宫颈鳞状上皮病变发生发展过程中em与转录因子表达的相关性研究

宫颈鳞状上皮病变发生发展过程中em与转录因子表达的相关性研究

宫颈是妇科最常见的肿瘤之一。随着近年外科技术的成熟与相关抗宫颈癌药物的临床应用,宫颈癌的综合治疗疗效显著提高。然而,由于迄今对宫颈癌恶性行为尚缺乏有效监控及治疗措施,仍有许多宫颈癌患者死于癌症复发和转移。因此,早期发现和治疗仍是降低宫颈癌发病率及死亡率的重要手段之一。上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是肿瘤形成及侵袭转移非常重要的过程,与恶性肿瘤发生关系密切。转录因子Twist及Snail被认为在多数肿瘤发生发展中,具有下调上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、上调弹性蛋白(vimentin)表达、诱导EMT及促进肿瘤形成与发展的作用。本研究通过探讨对慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(cervicalintra-epithelialneoplasia,CIN)及宫颈鳞癌中转录因子E-cadherin,Vimentin及Twist,Snail表达的检测及相关性分析,旨在为宫颈鳞状上皮肿瘤发生过程中,可能存在的生物学机制研究及宫颈癌的早期发现、治疗和预后监测等,提供科学有效的理论基础和依据。现将研究结果,报道如下。1对象和方法1.1纳入及被模型学检测的患者年龄分布选择荆州市妇幼保健院2005年1月至2009年12月宫颈组织活检及手术切除中,确诊为宫颈鳞状上皮病变的170例存档石蜡块标本为研究对象(均经10%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、HE染色,切片厚度为4μm,组织病理学结果经2位病理科医师诊断并复核)。其中,慢性宫颈炎标本为20例,纳入慢性宫颈炎标本组;CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ及宫颈鳞癌标本各为32例,27例,35例及56例,分别纳入CINⅠ组,CINⅡ组,CINⅢ组及宫颈鳞癌组。慢性宫颈炎组及CINⅠ～Ⅲ组患者年龄为27～70岁,中位年龄为42.5岁。宫颈癌组患者年龄为32～65岁,中位年龄为48岁;高分化为28例,中分化为23例,低分化为5例;按国际妇产科联盟(InternationalFederationofGynecologyandObstetrics,FIGO)对宫颈癌的临床分期(2000)为Ⅰ～ⅡA期。本组170例患者术前均未接受其他特殊治疗(包括放、化疗)(本研究遵循的程序符合荆州市妇幼保健院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,并与患者签署临床研究知情同意书)。1.2转录因子表达及转导法检测阴道循环治疗细胞培养采用原位杂交(insituhybridization,ISH)技术及细胞免疫组化SABC法,检测170例宫颈鳞状上皮病变组织标本中转录因子Twist,Snail及E-cadherin与Vimentin表达。1.2.1免疫组化试剂E-cadherin兔多克隆抗体,Vimentin小鼠单克隆抗体,即用型SABC免疫组化试剂盒,Twist,Snail的ISH试剂盒等,均购自武汉博士德生物工程有限公司。1.2.2免疫组化染色按照抗体说明书进行抗原修复,SABC法进行免疫组化染色。2种一抗的工作浓度均为1∶100,并均以0.1mmol/LPBS代替一抗作为阴性对照。1.2.3t,snail寡核苷酸探针t,snael寡核苷酸探针ISH探针为地高辛标记的Twist,Snail寡核苷酸探针,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。ISH采用PBS代替杂交液作为阴性对照。1.2.4n表达强度及判定标准以细胞内出现棕黄色颗粒判定为Twist,Snail及E-cadherin与Vimentin呈阳性表达。表达强度判定标准:每张切片随机选取5个高倍视野,计数阳性细胞数并计算百分率。E-cadherin,Vimentin表达结果判定:若阳性细胞<10%为(-),≥10%则为(+)。Twist,Snail表达结果判定:阳性细胞<5%为(-),≥5%则为(+)。1.3统计分析方法本研究数据采用SPSS11.5统计学软件包进行统计分析。多组数据阳性率(%)比较,采用秩和检验,相关性研究采用Spearman相关分析。以P<0.05示差异有统计学意义。2结果2.1不同时间点.e-cadhenin在慢性宫颈炎中的表达情况E-cadherin阳性信号定位于细胞膜。在慢性宫颈炎组中,E-cadherin于正常宫颈组织上皮细胞膜着色,细胞相邻处呈连续线性、极性分布,并主要集中于基底层及大部分棘层细胞,呈较强的细胞膜表达;在宫颈鳞癌组中,癌细胞膜着色浅淡,呈点状、小灶性分布,部分癌组织甚至完全不着色。E-cadherin在慢性宫颈炎组、CINⅠ～Ⅲ组及宫颈鳞癌组中的阳性表达率分别为80.0%(16/20),68.8%(22/32),55.6%(15/27),51.4%(18/35)及39.3%(22/56),在慢性宫颈炎→CINⅠ～Ⅲ→宫颈鳞癌的发展中,E-cadherin阳性表达率呈递减趋势,而且宫颈鳞癌组、CINⅢ组、CINⅡ组与慢性宫颈炎组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Vimentin阳性信号定位于细胞质。Vimentin在慢性宫颈炎组中,正常宫颈组织鳞状上皮层表达呈阴性或仅见单个细胞表达,而在CINⅢ组及宫颈鳞癌组中,细胞质Vimentin表达增强。Vimentin在慢性宫颈炎、CINⅠ～Ⅲ组及宫颈鳞癌组中的阳性表达率分别为0(0/20),6.3%(2/32),7.4%(2/27),31.4%(11/35)及32.1%(18/56),而且宫颈鳞癌组及CINⅢ组中的Vimentin的阳性表达率与慢性宫颈炎组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2.2snair阳性表达率Twist及Snail阳性信号定位于细胞质,部分定位于细胞核(图1、图2)。在慢性宫颈炎组、CINⅠ～Ⅲ组及宫颈鳞癌组,Twist阳性表达率分别为10.0%(2/20),28.1%(9/32),29.6%(8/27),42.9%(15/35)及64.3%(36/56);Snail阳性表达率分别为0(0/20),9.4%(3/32),22.2%(6/27),37.1%(13/35)及58.9%(33/56)。随着宫颈病变加重,Twist及Snail的阳性表达率逐渐增强,而且Twist及Snail在宫颈鳞癌组中的表达最强,与慢性宫颈炎组及CINⅠ～Ⅲ组的阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Twist在CINⅢ组的阳性表达率及Snail在CINⅡ组与Ⅲ组的阳性表达率,均显著高于慢性宫颈炎组,且差异有统计学意义(P<0.05)。2.3snair表达阳性标本中e-cadhenin表达的相关性CINⅠ～Ⅲ组及宫颈鳞癌组68例Twist呈阳性标本中,47例E-cadherin表达呈阴性,Twist与E-cadherin表达呈负相关关系(r=-0.373,P<0.05);55例Snail表达呈阳性标本中,34例E-cadherin表达呈阴性,Snail与E-cadherin表达也呈负相关关系(r=-0.200,P<0.05),而E-cadherin与Vimentin之间的相关性不明显(r=-0.125,P>0.05)。在CINⅢ组及宫颈鳞癌组标本中,Twist与Vimentin的阳性表达呈明显正相关(r=0.226,P<0.05),而Snail与Vimentin相关性不明显(r=0.098,P>0.05)。3snail与cin表达的相关性肿瘤细胞获得转移和侵袭能力,是肿瘤由良性发展成为恶性的重要阶段。EMT是指上皮细胞在特定生理和病理情况下,向间充质细胞分化的现象,即在EMT发生过程中,表现为上皮细胞失去极性,黏附能力下降,迁移和运动能力增加,同时细胞表型发生改变。其中,最为常见的就是上皮标志物E-cadherin基因蛋白下调,间叶表型标记物Vimentin表达上调及诱导EMT的一些转录因子,如Twist与Snail等亦表达上调。E-cadherin是一种钙依赖性细胞黏附分子,普遍存在于各类上皮细胞中,在维持正常上皮细胞形态、细胞极性及组织结构完整性中起重要作用。对身体多数部位发生的恶性上皮性肿瘤的研究表明,E-cadherin表达下调和功能丧失与肿瘤去分化、浸润性生长及转移等预后不良明显相关。Vimentin是细胞骨架蛋白之一,特异性分布于间质细胞中。若其在上皮源性肿瘤组织中过表达,则可能与细胞生长分化状态改变及细胞游走迁移有关,是EMT的表现。本研究结果显示,随着宫颈病变的进展,E-cadherin阳性表达率呈递减趋势,特别是在高级别CIN及宫颈鳞癌组织中的阳性率明显低于正常结构的宫颈组织,而且宫颈鳞癌组、CINⅢ组、CINⅡ组与慢性宫颈炎组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。而E-cadherin与Vimentin之间相关性不明显(r=-0.125,P>0.05)。宫颈癌组和CINⅢ组的Vimentin表达明显增强,而且宫颈鳞癌组及CINⅢ组中的Vimentin的阳性表达率与慢性宫颈炎组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。因此,在宫颈鳞状上皮性病变发展过程中,E-cadherin表达下调,Vimentin表达增强,细胞间黏附力减弱,肿瘤细胞彼此离散,向间质及周围移动,可能是良性宫颈鳞状上皮病变进一步癌变的促进因素。Snail属于锌指蛋白家族成员,是肿瘤发生发展过程中的一个重要调节因子,本质是一种转录抑制因子,可通过结合E-cadherin启动子的E-box连接基序,而直接抑制E-cadherin表达,进而诱导EMT,促使肿瘤细胞发生发展。免疫组化检测人类多数肿瘤标本中Snail蛋白发现,Snail异常表达于卵巢癌、甲状腺癌及恶性黑色素瘤等。体外实验构建正义全长Snail真核表达载体转染入宫颈癌细胞系Hela及SiHa,可明显抑制E-cadherin表达,而Vimentin与Snail表达明显上调。张儒英等采用免疫组化检测发现,Snail高表达于宫颈癌组织,其阳性率明显高于CIN组织,并且随着CIN级别升高,Snail表达越明显。这与本研究通过基因定位的结果一致。本研究结果显示,宫颈鳞癌中Snail阳性率显著高于宫颈鳞状上皮良性病变,并与E-caherin表达下调相关,但Snail与Vimentin的相关性并不明显(r=0.098,P>0.05),这可能与肿瘤发生发展阶段、分化程度及其他不确定因素等有关,认识二者在促进肿瘤形成中相互作用时,应结合其他临床指标综合考虑。本研究结果显示,Snail与E-cadherin表达也呈负相关关系(r=-0.200,P<0.05)。转录因子Twist是碱性螺旋-环-螺旋家族成员之一,广泛表达于中胚层起源组织细胞,参与中胚层发育及形态形成。随着对EMT生物学机制认识的不断深入,发现Twist也可通过抑制E-cadherin表达调节肿瘤细胞EMT。本研究结果显示,Twist在宫颈癌中高表达,同时伴随E-cadherin表达下调及Vimentin表达上调,Twist与E-cadherin表达呈负相关关系(r=-0.373,P<0.05),而与Vimentin的阳性表