糖尿病肾病大鼠模型制备方法及模型建立标准的研究

糖尿病肾病大鼠模型制备方法及模型建立标准的研究

近年来，随着人们生活水平的不断提高，饮食结构和工作方式的变化，糖尿病的发病率显著增加。其中糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最重要的合并症之一,是糖尿病患者的主要死因之一。约有30%的糖尿病患者发展为糖尿病肾病,且多数患者将进展为终末期肾病。但是糖尿病肾病的发病机制尚未完全清楚,药物干预手段较少,研究有待于深入,因此建立较理想的动物模型来研究该病的相关问题将具有重要意义。据报道目前已有十几种糖尿病动物模型,有些仅表现为轻度血糖升高,还有一些则不出现肾脏病变。其中出现肾脏病变的动物模型有如:db/db小鼠、KK小鼠、Gk大鼠、SHR/N-cp大鼠等。这些动物模型来源稀少,饲养条件苛刻,有些动物模型不能真正模拟人类糖尿病肾脏病变且模型建立标准不统一,不利于科学研究。急需来源广泛,经济廉价,易于控制的动物模型及一套完善的模型建立标准。近年来研究主要采用几种模型制备方法,单独链脲佐菌素造模,链脲佐菌素配合高脂高糖饮食,链脲佐菌素配合单肾切除,链脲佐菌素配合单肾结扎,但模型建立标准不尽相同,难以统一。通过文献查阅对以上几种模型制备方法进行分析、比较,总结出合理且易于控制的模型制备方法。对于模型建立标准,则提出一种思路。1模型制备方法的选择1.1糖尿病肾病大鼠模型的制备静脉或腹腔注射大量链脲佐菌素造成糖尿病模型,然后依其自然病情发展成糖尿病肾病模型。张润云等通过研究中药糖肾清1号对糖尿病肾病模型大鼠肾组织中纤维化因子表达的影响,进行糖尿病肾病大鼠模型制备,采用SD大鼠,SPE/VAF级,按64mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(STZ)柠檬缓冲液进行造模。王月华等通过研究活血化瘀消癥通络中药对糖尿病肾病的干预作用,进行糖尿病肾病大鼠模型制备,采用健康雄性SD大鼠清洁级一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg,72h后测血糖≥16.7mmol/L为糖尿病肾病模型建立标准。1.2糖尿病肾病模型制备高脂高糖饮食配合链脲佐菌素造成糖尿病模型,然后依其自然病情发展成糖尿病肾病模型。张燕等通过研究雷公藤多苷对糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子β1骨形成蛋白7及Gremlin表达的影响,采用SD大鼠进行糖尿病肾病模型制备,予高脂高糖饲料喂养4周,一次性腹腔注射40mg/kg链脲佐菌素。72h后采血测血糖,随机血糖≥16.7mmol/L为模型制备成功。田国伟等通过益气解毒活络法对早期糖尿病肾病大鼠血清脂联素与血清超敏C反应蛋白影响的实验研究,采用SD大鼠,高脂高糖喂养的大鼠均以35mg/kg(STZ)1次尾静脉注射,72h后尾静脉取血测量血糖值,以空腹血糖≥16.7mmol/L列入观察对象。1.3型糖尿病肾病大鼠模型的制备及造模方法的选择单侧肾脏切除后腹腔链脲佐菌素注射,然后依其自然病情发展为糖尿病肾病模型。李秀秀等通过研究益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠模型肾组织TLR4表达的影响,采取Wistar大鼠切除右侧肾脏,于右肾切除2周后,腹腔一次性注射50mg/kgSTZ,72h后尾尖采血,血糖高于16.7mmol/L为模型制备成功。张浩军等通过研究糖肾方对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1及MMP-9表达的影响,采用SPF级Wistar大鼠实施右侧肾切除,1周后按40mg/kg腹腔注射的链脲佐菌素,72h后尾尖采血测血糖,以高于16.7mmol/L为模型制备成功。通过大量文献查阅,国内普遍采用SD、Wistar大鼠进行模型制备,其来源广泛,经济廉价,饲养方便。王丽等通过实验对以上提到的几种常见的造模方法进行研究,结果显示高脂高糖饮食配合小剂量STZ诱导的2型糖尿病模型在切除肾脏后较早的出现了明显的蛋白尿以及糖尿病肾脏病理变化,明显有别于单纯STZ诱导的糖尿病模型。单侧肾脏的切除有助于加速肾脏的病变,其机制主要是单侧肾切除后导致了对侧肾脏的血流动力学改变,从而导致肾小球出现滤过性增高和高跨膜压的病理改变。所以,高脂高糖饮食联合单侧肾切除术后诱导出的糖尿病肾病动物模型具有成模率高、成模时间短、病理改变与临床贴近等优点。在前期试验中,采用单侧肾动脉结扎的造模方法,但是大鼠由于肾功能急剧衰竭极易死亡,因此认为单侧肾脏动脉结扎的方法不适于造模使用。芝敏等也对2型糖尿病肾病大鼠模型的建立进行研究,认为一次性大剂量注射STZ这种模型制作周期长,产生的肾脏损坏轻微,结果倾向于1型糖尿病肾病。同时也认为高脂高糖饮食配合STZ单肾切除,能够在短时间内获得较为满意的2型糖尿病肾病大鼠模型,并且采用3次小剂量注射STZ代替1次中计量注射STZ的方法,提高了成模率,缩短了成模时间。综上所述,三联法(高脂高糖饮食+手术切除单肾+STZ注射)已较为成熟,能够在短时间内获得2型糖尿病肾病大鼠模型,且病理改变与临床贴近,通过改变STZ的注射量、注射次数又能够有效的提高成模率。为复制糖尿病肾病大鼠模型的首选方法。2糖尿病肾病模型建立在糖尿病肾病大鼠的造模过程中,各家模型建立标准不尽统一。郑亚萍等对DN大鼠进行模型制备,采用单肾摘除配合高脂高糖和小剂量STZ的模型制备方法,在STZ注射72h后,将血糖高于16.7mmol/L为DN大鼠模型建立标准。黄平等对DN大鼠模型的复制,采用单肾切除配合STZ注射的模型制备方法,在STZ注射72h后,将血糖大于16.7mmol/L,尿糖阳性,尿量大于正常组50%者为模型复制成功。傅晓骏等对DN大鼠进行模型制备,采用高脂高糖配合STZ注射,STZ注射后72h,血糖≥16.7mmol/L为糖尿病模型复制成功,1周后留取大鼠尿即可,测尿微量白蛋白及肌酐,模型组的尿微量白蛋白/尿肌酐显著高于正常对照组,即为糖尿病肾病模型复制成功。马丽娟等采用高脂高糖配合STZ注射的造模方法,STZ注射后1周测空腹血糖和葡萄糖耐量实验2h血糖,取FPG≥7mmol/L和(或)2hPG≥11.1mmol/L者为2型糖尿病大鼠,成模大鼠在STZ注射后分别在6周和7周时用尿微量白蛋白试纸连续测大鼠晨尿3次以上,若为阳性,则为2型糖尿病肾病的大鼠。可见模型建立标准各异,规范不统一,不利于科研工作的开展进行,因此建立科学的统一的模型标准成为急需解决的关键问题。根据统计学的原理,在糖尿病肾病大鼠模型标准确定中可以引入医学参考值范围。医学临床中,常将就诊者的某些生理、生化、免疫学等指标的测定结果,与排除了对所研究指标有影响的疾病和有关因素的大多数“正常人”的相应数值进行比较,以就诊者的测定值是否超出了大多数“正常人”相应指标的波动范围,它主要用于划分正常与异常的界限,作为临床诊断的重要参考。因此参考值范围也称为正常值范围,是指绝大多数“正常人”的某指标值范围。这里的“绝大多数”可以是90%、95%、99%等,最常用的是95%。根据95%参考值范围进行计算可以得出大鼠正常的指标范围,参考正常的指标范围来确定诊断标准,也就确定了大鼠的模型建立标准。根据大量样本正常大鼠的血糖值统计结果推算出参考值范围,超出参考值范围即为异常,也就确定糖尿病大鼠的血糖成模标准。同理根据大样本大鼠尿蛋白的参考值范围推算出糖尿病肾病大鼠的成模标准。3糖尿病肾病大鼠模型制备方法通过大量文献查阅,分析、比较常见的几种糖尿病肾病大鼠的造模方法,认为三联法(高脂高糖饮食+手术切除单肾+STZ注射)已较为成熟,能够在短时间内获得2型糖尿病肾病大鼠模型,且病理改变与临床贴近,通过改变STZ的注射量、注射次数又能够有效的提高成模率。如不采用高脂高糖饮食,单肾摘除配合增加STZ注射剂量,则模型更接近1型糖尿病大鼠模型。综上方法为糖尿病肾病大鼠模型制备的首选方法。成模标准则根据统计学原理,医学参考值范围进行确定。4实验动物的基本特征实验动物的医学参考值范围需要大样本统计计算,因此通过对大量的实验动物生理正常值的统计,来建立地区内、范围内的实验动物数据库,对于实验造模等科学研究工作都有重要意义。包玉龙、杜佳林等通过大样本的统计分析,得出辽宁地区辽宁地区普通级和SPF级SD大鼠血液生理、生化指标。这样的基础性实验不断积累,使地域内实验动物的数据库不断完善,有利于动物实验的规范化。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新的组学技术,是近年来研究的热门学科,代谢组学概念:可以定量测定生物体系对病理生理刺激或遗传因素改变所产生的代谢应答的一种方法。代