cyp27a1致散发性脑腱黄瘤1例

cyp27a1致散发性脑腱黄瘤1例

肝障瘤（ctx，om:213000）是一种常见的染色体隐性遗传疾病，通过脂质代谢障碍将导致各种组织和器官功能障碍。该疾病的主要临床特征是肌腱黄瘤、障碍、腹泻和骨质疏松症。此外，患者还可能出现精神障碍和神经系统损伤引起的共济失调症状。1991年,CYP27A1被确定为该病的致病基因。CYP27A1位于染色体2q35,包含9个外显子,编码固醇27-羟化酶。CYP27A1基因突变使固醇27-羟化酶活性减低或丧失,使体内的胆固醇不能有效地代谢转化为胆汁酸,引起胆固醇及胆甾烷醇在体内多组织异常沉积,从而导致疾病的发生。本研究对1例脑腱黄瘤病患者进行CYP27A1突变检测,以探讨其分子发病机制,现报告如下。1对象和方法1.1x线片示试验患者,女,21岁,广州人,父母健康,为独生女,生长发育过程基本正常,自幼智力稍低于同龄人,学习成绩较差。14岁时发现双侧跟腱肿物伴跟腱增粗(图1),无疼痛感,行走平稳,病理活检显示增生的纤维组织中见片巢状黄瘤细胞、组织细胞和多核巨细胞,并可见胆固醇结晶裂隙,诊断为黄瘤病。15岁时行双侧先天性白内障手术。行平路正常,但上下楼梯有不稳感。体格检查:神清,对答正常,反应稍慢。向右凝视可见粗大水平眼震,右手指鼻稍欠准,步态正常。双侧跟腱肿大,深部及两侧可扪及稍硬的肿块,大小约11cm×4cm,无痛,踝关节活动度尚可。血总胆固醇5.73mmol/L,HDL1.65mmol/L,LDL3.66mmol/L。双踝关节MRI:双侧跟腱自腓肠肌移行处至跟腱跟骨附着处明显增粗,呈肿块样改变,右侧为11.4cm×3.1cm×3.4cm,左侧为11.0cm×3.0cm×3.1cm,T1WI呈均匀稍低信号,T2WI呈等、高混杂信号。头颅MRI:T1WI示双侧小脑齿状核对称性不均匀稍低信号,边界不清(图2A),T2WI高信号(图2B),FLARE稍高信号,无明显水肿和强化,增强未见强化(图2C)。脑部其余部位未见异常。X线片示双侧跟骨骨质密度稍降低,腰椎骨密度低于同龄人。中国修订韦氏成人智力量表检查结果:言语量表47分,操作量表21分,总分68分;中国修订韦氏成人记忆量表检查结果:记忆商数78分。临床确诊为脑腱黄瘤病。1.2方法1.2.1样品采集与dna提取1.2.2配合物pcr检测从UCSC数据库(http://ge-获取CYP27A1基因的序列,利用Oligo6.0软件自行设计9对PCR引物,并由深圳华大基因研究院合成,详细引物序列见表1。第1外显子PCR反应体系为:2×GCBufferⅠ15μL,2.5mmol/LdNTP混合物2.5μL,LATaqDNA聚合酶0.25μL,3.2μmol/L上下游引物各1μL,DNA模板2μL,灭菌ddH2O补足体积至30μL。对应反应条件为touch-downPCR:95℃预变性3min;95℃变性30s,68℃退火30s,72℃延伸45s,下1个循环的退火温度依次降低1℃,共10个循环;95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,共26个循环;72℃10min。其余外显子PCR反应体系为:10×扩增缓冲液3μL,25mmol/LMgCl23.5μL,2mmol/LdNTP混合物3μL,TaqDNA聚合酶1μL,3.2μmol/L上下游引物各1μL,DNA模板1μL,灭菌ddH2O补足体积至30μL。对应反应条件为:95℃预变性3min;95℃变性30s,表1所列引物特异性温度退火45s,72℃延伸1min,45个循环后72℃10min。1.2.3搜索顺序的确定2前3位t经测序分析患者CYP27A1基因的9个外显子及相应剪切位点序列,在第2内含子检测到1个剪切位点杂合突变c.446+1G>T;第5外显子发现2个杂合错义突变c.877A>T(p.Met293Leu)和c.1016C>T(p.Thr339Met)。剪切位点突变c.446+1G>T使第2内含子的剪切供体GT改变为TT,错义突变c.877A>T使293位密码子由ATG改变为TTG,使编码氨基酸由甲硫氨酸变为亮氨酸,通过检索证实以上2个突变为国内外尚未报道的新突变,2个突变分别在105名(210个等位基因)无脑腱黄瘤病表型且无亲缘关系的正常人中进行测序筛查,均未被检出。而另一错义突变c.1016C>T使339位密码子由ACG改变为ATG,使编码氨基酸由苏氨酸变为甲硫氨酸,该突变为国内外已报道的突变。对上述3个突变在患者父母中做测序检测,证实患者从母亲继承突变c.446+1G>T和c.877A>T,从父亲获得突变c.1016C>T(图3)。3cyp27a1基因突变胆固醇在体内的主要代谢通路是在肝细胞中转化为胆汁酸,CYP27A1基因编码的固醇27-羟化酶催化由胆固醇合成胆汁酸的初始氧化反应。CYP27A1基因的突变使固醇27-羟化酶活性降低或丧失,胆固醇不能有效转化为胆汁酸,过量的胆固醇和胆甾烷醇在体内多个组织异常沉积,从而导致脑腱黄瘤病的发生。从突变类型来看,CYP27A1基因的突变主要为错义突变和无义突变,其次为剪切位点突变、小片段的缺失和插入。固醇27-羟化酶属于线粒体细胞色素P450家族的一员,长度为531个氨基酸,包含肾上腺皮质铁氧还原蛋白结合位点(adrenodoxin-bindingsite)和血红素结合位点(heme-bindingsite)2个重要位点,这2个位点对于维持固醇27-羟化酶的活性具有重要作用,既往研究数据也表明,这2个位点所在区域为突变高发区域。本研究在1例21岁女性脑腱黄瘤病患者CYP27A1基因中发现1个剪切位点突变和2个错义突变。患者遗传自母亲的剪切位点突变c.446+1G>T和错义突变c.877A>T均为国内外尚未报道的新突变。由于这2个突变均来自于母亲,故它们位于同一条染色体上。CYP27A1基因第2内含子剪切位点曾有c.446+1G>A的突变报道,但本研究发现的为c.446+1G>T,与已报道的不同,故为新突变。突变c.446+1G>T使第2内含子剪切供体由GT改变为TT。该突变的发生将干扰第2外显子与第3外显子之间的正常剪切,故有可能使编码肽链截断,由于其出现在突变c.877A>T上游,故突变c.877A>T对患者而言可能并无实际意义。患者遗传自父亲的错义突变c.1016C>T是目前已报道最常见的突变之一。在已研究的荷兰人群中,几乎2/3的患者被检测到携带c.1016C>T突变,这一现象提示该突变在荷兰可能存在建立者效应。在蛋白质空间三级结构上,突变c.1016C>T可能由于空间位置紧邻肾上腺皮质铁氧还原蛋白结合位点,影响该位点与肾上腺皮质铁氧还原蛋白的正确结合,从而降低固醇27-羟化酶的活性。由此可见,患者遗传自父母的突变均可影响基因编码产物固醇27-羟化酶的功能,阻碍体内胆固醇的代谢,导致疾病的发生。脑腱黄瘤病典型的临床症状大都要等成年以后才呈现出来,并且有些患者无跟腱黄瘤这一特征性临床表现,本例患者以跟腱黄瘤病起病,伴有白内障和轻度的智力障碍(以操作智商损害明显,语言和记忆商数损害不明显),头颅MRI提示小脑齿状核异常信号,但共济失调症状不明显。从起病到确诊历时7年,提示本病患者尤其是幼年期患者的临床确诊比较困难,而早诊断并及时予以鹅去氧胆酸治疗能明显改善临床症状、延缓疾病进程。因此,当未成年病患出现原因不明的跟腱肿物、智力低下、白内障及顽固性腹泻等症状时,鉴别诊断时应考虑患本病的可能性,如条件成熟,建议尽早做CYP27A1基因的突变筛查分子诊断。值得一提的是,除了CYP27A1基因突变可致脑腱黄瘤病,目前尚不能排除其他潜在致病基因存在的可能性,因为胆汁酸生物合成的过程需要多个酶的参与,而理论上相关基因的突变都可能会影响这些酶的活性,从而影响胆汁酸的生物合成过程,产生类似于脑腱黄瘤病的临床表型。综上所述,本研究对1例脑