锁阳多糖对d-半乳糖衰老模型小鼠血液及脑组织端粒长度的影响

锁阳多糖对d-半乳糖衰老模型小鼠血液及脑组织端粒长度的影响

《锁阳》是《草本植物》的一种附属药物。它的药效因素是“锁阳、长盛不衰”，也被称为“不老药”。我国西部有丰富的锁阳资源,内蒙古是其主产地之一。锁阳性味甘、温,有补肾助阳、益精血,润肠通便等功效。现代研究发现,锁阳有清除氧自由基、抗氧化、抗缺氧、抗应激、抗疲劳、抗癌、抗HIV以及润肠通便等作用。本课题组在以往的工作中也发现以多糖为主要成分的锁阳水提物有对衰老小鼠的抗氧化作用,锁阳多糖有明显的抗免疫作用和促进体外培养骨髓细胞增殖的作用。为探讨锁阳多糖对衰老小鼠基因功能的影响,现进一步研究其抗衰老的作用机制。1材料表面1.1动物昆明种小鼠,内蒙古大学实验动物中心提供,合格证号SCXK(蒙)2002-0001。1.2csp的提取和鉴定锁阳,自采于内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗独贵特拉镇,经内蒙古大学生命科学学院生物系陈贵林教授鉴定。新鲜锁阳除去花序,自然干燥,粉碎,过80目筛,置于硅胶干燥器中备用。自制锁阳多糖:取锁阳粉末,加95%乙醇浸泡脱脂,离心取沉淀,按料液比1∶15加水,94℃下水浴提取2h,重复提取2次。上清液加95%乙醇使醇含量达到80%以上,放置24h后离心,沉淀用丙酮、无水乙醇、90%乙醇各洗涤2次得粗多糖。粗多糖加水复溶,过滤除去沉淀,以5%三氯乙酸、Sevag法去蛋白各2次,再次醇沉,沉淀物重新溶解于水,去离子水透析3d后醇沉,沉淀物经无水乙醇至80%乙醇分级醇洗,真空干燥至恒重,得锁阳多糖(CSP),CSP得率1.24%。将所得CSP加水溶解,以苯酚-硫酸法测得多糖含量为93.2%。经紫外光谱测定,在260nm无吸收,280nm有小吸收峰,说明CSP样品不含核酸类物质,含少量蛋白杂质。精制的CSP经凝胶高效液相色谱测其平均分子质量1.29×105。黄芪多糖,自制,制备方法同CSP,含量91.8%。1.3dp323号dp333离心柱法基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技公司,批号DP318);荧光定量PCR试剂盒SYBR(R)PremixExTaqTM(PerfectRealTime)(大连宝生物公司,批号DRR041S)。1.4仪器ABI7300实时定量PCR仪(AppliedBiosceince,FosterCity,CA)。2方法2.1模型组及给药组小鼠60只,体重18~22g,雌雄各半。随机分为6组:正常组、衰老模型组、CSP低、中、高剂量组、黄芪多糖组,每组10只,雌雄各半。模型组及给药组每日腹腔注射50g·L-1D-半乳糖500mg·kg-1·d-1,正常组给同容积生理盐水。CSP低、中、高组每日灌胃CSP剂量分别为20,40,80mg·kg-1·d-1,黄芪多糖40mg·kg-1·d-1,正常组和模型组以等量蒸馏水灌胃。2.2红细胞裂解法连续给药8周后摘眼球取血约1mL,颈椎脱臼致死,取脑组织迅速液氮保存。血样经1000r·min-1离心10min,上清弃去,血凝块-20℃保存。冰冻血凝块溶化后在PE手套内挤碎,加入红细胞裂解液1mL,混匀器混匀15s,1万r·min-1离心1min,弃上清,加红细胞裂解液500μL再次处理后按试剂盒操作,得到DNA样品100μL。所得DNA样品-20℃保存待测。脑组织样品取约500mg,研细后按试剂盒提取操作,步骤与血液相同,冷冻保存DNA样品待测。经核酸测定仪测定DNA为160~400mg·L-1,A260/A280=1.86~1.93。2.3pcr实时荧光测定和端粒长度2.3.1基因的合成端粒上游引物5′-GGTTTTTGAGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGGAGGGT-3′,下游引物5′-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3′。参比的单拷贝基因为36B4基因,上游引物5′-ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG-3′,下游引物5′-TCAATGGTGCCTCTGGAGATT-3′,引物均由大连宝生物公司合成。引物使用浓度10μmol·L-1。2.3.2引物pcr扩增每个PCR反应体系包括:SYBRPremixEXTaq10μL,ROXReferenceDye0.4μL,上、下游引物各0.4μL,稀释100倍后DNA模板1μL,加灭菌水至20μL。混匀后扩增。端粒扩增条件:94℃10s预变性,然后95℃5s,52℃31s,40个循环。36B4基因扩增条件:94℃10s预变性,然后95℃5s,54℃31s,40个循环。应用ABI7300实时定量PCR仪进行检测、记录和分析。2.3.3标准曲线的绘制任意取一份待测样品作为模板,按10倍梯度稀释共5个浓度作标准曲线,以模板样品的稀释倍数的log值对样品达到一定阈值所需的循环数(thresholdcycle,Ct)做标准曲线。2.3.4端粒dna长度的测定待测DNA稀释样品取1μL加入到20μLPCR反应体系,每份模板分别测定端粒基因及36B4基因的Ct值,重复测定3次,取平均值进行计算。以T/Sratio计算端粒DNA的长度。T/Sratio=[2Ct(telo)/2Ct(36b4)]-1=2-[Ct(telo)-Ct(36b4)]=2-ΔCt。为比较观察药物的作用,再以D-半乳糖衰老模型组的平均ΔCt为对照,求相对T/Sratio,相对T/Sratio=2-ΔΔCt。2.4统计方法实验数据以x¯±sx¯±s表示,应用SPSS11.0软件采用单因素方差分析比较各组间的显著性差异。P<0.05表示差异有显著性。3结果3.1b4基因标准曲线模板梯度稀释的端粒基因引物标准曲线r2=0.990,斜率=-3.02,36B4基因标准曲线r2=0.993斜率=-3.49。端粒基因在模板浓度1~10-3倍稀释线性关系良好,扩增效率高。36B4基因线性范围1×10-1~10-4倍。熔点曲线见图1,2,可见扩增产物特异,适合定量。3.2不同给药剂量对d-半乳糖致衰老的单次给药后相对端粒长度的影响结果显示,CSP中、高剂量组T/Sratio与模型组相比在血液和脑组织中差异均有统计学意义,两组织的端粒长度变化趋势一致。血细胞和脑组织中D-半乳糖致衰老模型组同正常组相比相对端粒长度均明显缩短(P<0.01)。给药后,血细胞中、高剂量CSP给药组和黄芪多糖组同模型组相比,相对端粒长度均有明显增加(P<0.01),低剂量组没有明显影响。脑组织各给药组同模型组相比相对端粒长度均有明显增加(P<0.01)。血细胞与脑组织端粒长度在正常与衰老模型小鼠中均有明显不同(P<0.05)(表1)。4抗衰药物可选用模型的建立实时定量(realtimequantitative)PCR法包括荧光嵌合法(SYBRGreenⅠ),荧光探针法等,SYBRGreen法简单易行,价格相对较低,该法测定端粒相对长度准确性强、灵敏度好,该方法可用来替代传统的Southernblot,Q-FISH等方法测定端粒、端粒酶。端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构,由端粒DNA和端粒蛋白质组成。端粒DNA是富含G的高度保守的重复核苷酸序列,人和其他哺乳动物的端粒DNA序列均由5′-3′方向(TTAGGG)n反复串联组成,它参与DNA复制,对维持染色体的稳定和完全复制有重要作用。正常动物细胞DNA的端粒随着细胞分裂而缩短,端粒的长度在多种类型的衰老的体细胞中都呈现出末端重复序列的丢失,当端粒缩短到临界长度时细胞将停止增殖并死亡。端粒的丢失可以用来衡量培养基中再生细胞的衰老程度,而且在体内可根据它判断细胞供体的年龄,这种功能已经在人类多种细胞或可再生组织中得到了证实。由于端粒的功能性丧失可以触发细胞周期的停止引起衰老,因此对引发端粒重复序列丢失的模型的研究将会成为抗衰老药物发现和开发的另一个途径。本实验的致衰模型采用D-半乳糖法,D-半乳糖是一种二醛糖,在醛糖还原酶作用下被还原成半乳糖醇后,不能被细胞进一步代谢,而堆积在细胞内,引起氧化应激、自由基损伤及诱导醛糖还原酶活性增强等一系列病理生理变化,使细胞肿胀、代谢紊乱,引发衰老。本实验发现D-半乳糖能明显降低血液和脑组织细胞端粒长度,可能通过端粒机制触发衰老过程,进一步说明了用D-半乳糖造衰老模型的方法是可行的。已有研究表明,不同组织的端粒长度并不完全相同,本实验研究的结论与之类似,2种组织端粒长度