康泰胶囊对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠黏膜crh-r1mrna表达的影响

康泰胶囊对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠黏膜crh-r1mrna表达的影响

肠易激综合征（ibs）是一种常见的临床胃肠功能疾病。它是由腹痛、腹胀和粪便（腹泻和便秘）引起的临床表现为虚假大便（粪便和粘膜大便）引起的症状。没有具有组织特征的疾病（形态、细胞学和生物化学代谢指数等）。由于病因及其发病机制尚不十分明了,因此,目前临床尚缺乏单一、安全、完全有效的治疗IBS的药物。康泰复方是广州中医药大学周福生教授总结多年临床经验用来治疗腹泻型肠易激综合征(D-IBS)的经验方。本实验采用内脏高敏感性大鼠模型,观察康泰复方对模型大鼠直肠扩张后腹部回缩反射阈值(AWR)的影响,以及结肠黏膜促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)及CRH-R1mRNA的表达,初步探讨康泰复方治疗D-IBS的可能机制。1材料表面1.1动物1.2人体润滑试剂马来酸曲美布汀片(商品名:舒丽启能,天津田边制药有限公司生产,生产批号:国药准字H20030290);醋酸(广州化学试剂厂,批号:200305012);人体润滑剂;血压计(鱼跃牌);避孕套(第六感超薄型);2mL注射器;输液导管(直径1mm)。cDNA试剂盒(Fermentas公司),Trizolreagent(Invitrogen公司),TaqDNA聚合酶(上海申能博彩生物科技有限公司),引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。1.3中药风味处理康泰胶囊(由防风、白芍、木香等组成)由南方医科大学珠江医院制做,生产批号:20080901,1g药粉相当于生药量4.1g。2方法2.1高敏感大鼠模型的复制和评估2.1.1单次给药和实验操作新生育龄7天SD大鼠100只,随机分出10只为正常组。其余为模型组,每10只与其母鼠共同饲养在同一笼内,模型组自第1天开始,每天给予直肠内醋酸刺激:将人体润滑剂润滑后的输液导管(直径1mm)经肛门插入2cm。注入0.5%醋酸0.5mL,连续刺激14天。在第14天后的2周内,不进行任何实验操作。发育至大鼠25天育龄后,将母鼠与幼鼠分离。分离后的大鼠每5只一笼,给予足够的食物、水分。2.1.2大鼠好的打气充压awr上述模型大鼠在直肠刺激停止2周后(第5周),评价大鼠AWR。将血压计、针管与自制指套气囊用三通管连接,用针管向气囊内打气时可以在血压计上读出气囊内压力。大鼠在清醒状态下,将人体润滑剂润滑后的气囊经肛门插入约5cm,用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起,固定气囊。将其放在特制的透明塑料笼内,大鼠在此笼内不能转身。15min后待大鼠适应环境,逐渐打气扩张肠道,评价其AWR;观察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的压力阈值。2.2按照不同的给药方案,在灌胃时保证治疗上述模型组动物在模型复制成功后,在大鼠7周龄时,按体重随机分为对照组、康泰胶囊高、中、低剂量组和西药组,每组10只,分别给予生理盐水、康泰胶囊1.52、3.04、6.08g/kg(分别相当于成人用量的5、10、20倍)及马来酸曲美布汀片0.1g/kg灌胃,每天1次,连续灌胃2周。正常组不灌胃。各组常规饲料喂养、给水。治疗后再次进行内脏高敏感性评估,比较用药组与对照组间的统计学差异。2.3逆转录-聚合酶链反应rt-pcr大鼠麻醉后立即开腹取远端结肠组织2块放入液氮速冻后转至-80℃低温冰箱储存备用,用于RT-PCR检测使用。具体方法如下:(1)按试剂盒步骤提取标本中的mRNA,在紫外/可见光分光光度计上检测吸光度(A)值:A230、A260和A280,获取样品中RNA纯度和含量,并计算出5g总RNA所需用量。(2)确定CRHSense:5’ATCTCACCTTCCAC-CTTCT3’;Anti-sense:5’CTCTTACACTGTGTCTCCAA3’。CRH-R1Sense:5’TTGTGTCTGTGTTCTACTGT3’;CRH-R1β-actinSense:5’CCATTGAACACGGCATTG3’;Anti-sense:5’ACTGCTTGATGCTGTGAA3’。β-actinAnti-sense:5’TACGACCAGAGGCATACA3’。扩增长度CRH463bp、CRH-R1162bp、β-actin234bp。(3)采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)逆转录反应按以下条件:70℃水浴5min,冰上冷冻。离心片刻,加人1μL(200U/μL)ReverAidM-MuLV反转录酶,42℃水浴60min进行反转录。(4)PCR反应条件如下:95℃预变性3min,94℃变性30s,52℃～56.5℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环后72℃延伸10min。PCR反应产物电泳鉴定:用凝胶成像仪自带分析软件计算电泳条带的光密度积分值,以样品与内参光密度积分值的比值反映各基因表达的强弱,从而对RT-PCR的电泳结果进行半定量分析。2.4组间差异统计分析数据用SPSS17.0统计软件进行统计分析,本实验所有数据以表示,2组间差异用t检验,多组间差异用单因素方差分析(ANOVA)进行统计。3结果3.1大鼠内脏高敏感性检测见表1。采用幼鼠母子分离加直肠刺激法复制内脏高敏感性D-IBS大鼠模型,对照组大鼠在出生后第6周其抬腹和拱背压力阈值均低于正常组(P<0.05),说明其内脏高敏感性显著升高,造模成功。3.2两组大鼠内脏高敏感性比较见表2。D-IBS内脏高敏感性大鼠经康泰胶囊治疗2周后,各剂量组大鼠内脏高敏感性较对照组降低(P<0.05),且康泰胶囊中、高剂量组已恢复到接近正常组水平(P>0.05)。提示康泰胶囊对D-IBS模型大鼠内脏高敏感性有改善作用。3.3两组大鼠crh-s1mrna值比较见表3。造模后对照组CRH-R1mRNA表达升高,与正常组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。康泰胶囊治疗后,各剂量组D-IBS大鼠CRH-R1mRNA值表达均低于对照组(P<0.05);其中,低剂量组、高剂量组与正常组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。康泰胶囊各剂量组D-IBS大鼠的肠黏膜CRHmRNA值均有不同程度的降低,但是与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。4康泰胶囊对d-ib-crhmrna表达的影响D-IBS是一种以腹部不适或腹痛伴排便习惯和(或)大便性状改变为特征的功能性疾病。目前,纵观D-IBS的所有发病机制假说,都不可避免的与肠道神经系统和中枢神经系统的生理或生化异常相关。本实验结果显示,对照组大鼠在造模后其抬腹和拱背的压力阈值低于正常组(P<0.05),说明其肠道敏感性显著升高。肝郁脾虚证是D-IBS临床上最为常见的证型之一,临床上多用疏肝健脾法治疗,以痛泻要方加减治疗多见[4～5]。康泰胶囊是周福生教授根据D-IBS的发病机制及“心胃相关”理论,根据多年临床经验,以疏肝健脾、和胃安神法组方的临床经验方。前期临床实验结果显示该方对D-IBS疗效高达90%,能显著改善患者的临床症状,而且能调整患者的内脏高敏感性,对患者的T细胞亚群也有一定的调节作用。本实验结果证明,康泰胶囊可以提高D-IBS大鼠的内脏高敏感性压力阈值,且中、高剂量组可恢复到接近正常组水平,提示康泰胶囊对内脏高敏感性大鼠有改善作用。D-IBS的发病机制与肠道神经系统及中枢神经系统的生理或生化异常有关。目前认为,脑肠互动是D-IBS主要发病机制之一,CRH通路作为主要介导应激引起脑肠互动的主要通路,在脑肠轴中发挥重要的作用。CRH通路主要包括上游信号通路及下游信号通路,上游信号通路包括CRH及相关受体,而下游信号主要是指CRH与相关受体结合后触发的一系列信号反应。CRH受体分2种亚型:CRH-R1和CRH-R2。CRH作为重要的应激激素,广泛地分布于中枢及外周组织,参与神经内分泌、自律性、行为学、炎症反应和神经精神疾病的调控。在应激反应中,可以观察到CRF的释放,表明CRF在中枢应激反应中起重要作用。在本实验中,对照组D-IBS大鼠结肠CRH及CRH-R1mRNA的表达阈值较正常组增高,且在肠黏膜CRH-R1mRNA的表达上,正常组与对照组存在显著性差异(P<0.05)。这与OkanoS、VizzardMA等[7～8]在大鼠脑室及静脉注射CRH模拟出的应激条件下出现的结肠运动加快,结肠传递时间缩短、排便等现象相一致,说明肠道CRH及CRH-R1参与了结肠运动的调控。但是在肠道CRHmRNA的表达上,模型组与正常组差异并无统计学意义,考虑可能是由于CRH存在于肠道黏膜的表达不多所致。本实验结果显示,与对照组比较,康泰胶囊各剂量组CRHmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),但较对照组均有不同程度的降低趋势,这是否提示其对D-IBS的作用机制可能与影响肠黏膜CRH的表达相关。而在CRH-R1mRNA表达上,康泰胶囊低、中、高剂量组均较对照组降低(P<0.05),提示康泰胶囊可能通过抑制肠黏膜CRH-R1起到治疗D-IBS的作用。综上所述,基于“心胃相关”理论组方的康泰胶囊能降低D-IBS内脏高敏感性大鼠肠黏膜CRH及CRH-R1mRNA的表达,其作用机制可能与影响脑肠轴CRH通路有关。同时也从反面论证了CRH通路是影响D-IBS发病的重要机制之一。临床许多D-IBS患者在经过康泰胶囊治疗