硝苯地平控释片体外释片的释药特征和体内药动学研究

硝苯地平控释片体外释片的释药特征和体内药动学研究

硝基苯地平是第一种抗高血压药物二羟吡啶。它是治疗心绞痛、高血压和其他心血管疾病的常用药物，具有很好的临床疗效。硝苯地平普通口服制剂在胃肠道内吸收迅速而且完全,具显著的降压作用,可能出现低血压等不良反应症状。而硝苯地平控释片是采用双层渗透泵技术制成的一种新型控释制剂,通过半透膜调控的推拉渗透泵的原理,使药物以零级速率释放,一日服药一次即可平稳控制患者血压,患者的顺应性佳,不良反应少,因而在临床上应用较广。本研究以进口硝苯地平控释片为参比制剂,测定自制硝苯地平控释片在不同pH介质中和不同转速下的释放度,考察体外药物释放特征;测定单剂量口服硝苯地平控释片后健康受试者体内的血药浓度,计算药动学参数,并进行生物等效性研究。1仪器和试剂RCZ-8B溶出试验仪(天津大学无线电厂精密厂);RZQ-8A型自动取样器(天津大学无线电厂精密厂);S53型紫外分光光度计(上海棱光技术有限公司);Agilent6890N气相色谱(美国安捷伦公司);Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);硝苯地平控释片自制制剂(久保平●,北京红林制药有限公司,批号070901,剂量:30mg);硝苯地平控释片进口制剂(拜新同●,拜耳医药保健有限公司,批号111002,剂量:30mg);硝苯地平和地西泮对照品均购自中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯;健康人空白血浆由北京红十字血液中心提供。2方法2.1外释放率测定2.1.1释放介质ph值对硝苯地平控释片释放度的影响分别采用1%十二烷基硫酸钠的人工胃液(pH1.2)、1%十二烷基硫酸钠的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)、1%十二烷基硫酸钠的磷酸盐-枸橼酸缓冲液(pH6.8)、1%十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为释放介质来测定硝苯地平控释片的体外药物释放度,考察释放介质pH值对硝苯地平控释片释放度的影响。2.1.2条件1用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水(3∶2)为流动相;检测波长为235nm。2.1.3标准曲线及回收率分别采用不同pH的释放介质为溶剂,分别配制36mg·L-1的硝苯地平对照品溶液,另取相同比例空白辅料配制空白溶液,各取对照品溶液和空白溶液20μL,注入液相色谱仪,考察空白辅料对测定的干扰性。取自制硝苯地平控释片(研细)适量,分别加入不同pH的释放介质,溶解,并分别配成36mg·L-1的供试品溶液,放置48h,分别于0,8,12,24,48h时,注入液相色谱仪,记录峰面积,考察供试品溶液的稳定性。分别配制质量浓度为2,5,10,20,25,40,50mg·L-1硝苯地平对照品溶液,同法测定其峰面积,绘制标准曲线,考察线性关系。称取硝苯地平对照品和相应比例空白辅料适量,以不同pH的释放介质分别配制质量浓度约为2.7,18,45mg·L-1的溶液各3份,各取20μL,注入液相色谱仪,测定峰面积,计算回收率;配制质量浓度约为18mg·L-1的溶液各6份,各取20μL,注入液相色谱仪,测定峰面积,考察方法的重复性。2.1.4测定释放介质流量取本品,照释放度测定法采用溶出度测定法装置,将片子放入小金属网篮内,分别以不同pH介质900mL为释放介质,转速为100r·min-1,依法操作,在4,8,12,16,24h时各取溶液8mL,滤过,并同时补充相同温度、相同体积的释放介质。精密量取续滤液20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图;根据标准曲线分别计算每片在不同时间的释放量,折算出每片在不同时间点的平均累积释放百分数。2.1.5转速对硝苯地平控释片释放度的影响以1%十二烷基硫酸钠的磷酸盐-枸橼酸缓冲液(pH6.8)为释放介质,转速分别为50,75,100r·min-1,依法操作,考察转速对硝苯地平控释片释放度的影响。2.2血药浓度测定方法将入选的24名健康受试者随机分为2组,每组分别交叉口服30mg硝苯地平控释片自制制剂或进口制剂。受试者于给药前一天晚饭后禁食至给药后4h,试验当天午餐给予标准餐。受试期间饮水适量。试验于晨8:00左右开始,于服药前和服药后1,2,3,4,6,8,12,16,20,24,30,36,48,60h,在上肢肘窝静脉取血4mL,离心分离血清后,标本置-40℃冰箱待测血药浓度。给药当天和第2天观察一般情况、进行体格检查,必要时随时检测实验室指标。试验中严格进行药物不良反应事件的记录。2.3给药血药浓度的测定2.3.1电子捕获分离器Agilent6890N气相色谱,HP-5石英毛细管色谱柱(0.32mm×30m,0.25μm),电子捕获检测器,载气为高纯氮,柱前压:150kPa。进样口温度:150℃;检测器温度:280℃;柱温:150℃;维持1min,以40℃·min-1升至260℃(4.5min)。2.3.2样品的制备和纯化采用液液萃取法。取血清标本1000μL于10mL塑料离心管中,分别加入质量浓度为2.1mg·L-1内标(地西泮)工作液50μL和40%氢氧化钠水溶液50μL,振荡混匀,加入3mL醋酸乙酯,200r·min-1摇床振摇30min,4000r·min-1离心10min,上清液转移到另一试管中,65℃恒温水浴下氮气吹干,残渣用100μL甲苯溶解后,置自动进样器小瓶中,进样2μL。2.3.3方法研究(1)gl-1硝苯地平工作液取空白血清5.8mL加入0.2mL质量浓度为10.1mg·L-1的硝苯地平甲醇溶液,混匀后,得到质量浓度为336.67μg·L-1硝苯地平工作液。取硝苯地平工作液1mL于盛有4mL空白血清的试管中,混匀,得到质量浓度为67.3μg·L-1的样品溶液;取出2mL于下一个盛有2mL空白血清的试管中依次操作(2倍稀释),最终得到质量浓度分别为67.3,33.67,16.83,8.42,4.21,2.10μg·L-1的线性样品1～6,制备好的线性样品按照每管0.5mL的量分装,冷冻避光保存,待用。(2)l-1学习算法取6mL空白血清加入1mL硝苯地平工作液,混匀后作为质控样品的高浓度点(QCH,质量浓度为48.1μg·L-1);取3mL空白血清加入1mL硝苯地平高浓度点血样,混匀后作为质控样品的中浓度点(QCM,质量浓度为12.02μg·L-1);取3mL空白血清加入1mL硝苯地平中浓度点血样,混匀后作为质控样品的低浓度点(QCL,质量浓度为3.01μg·L-1)。分别考察方法的专属性、定量限、线性范围、回收率、精密度和样品的稳定性。2.4属性总数量:请看各度,并收集并确定自动收集单对所得到的每一个峰浓度数据经过判断确认后,录入电脑,采用加权回归的方法计算每一个点的药物浓度,并用Excel进行汇总;对汇总的数据用DAS程序进行药动学计算,计算过程按非房室模型进行,tmax、Cmax采用实测值,AUC采用梯形法计算。对受试者在不同周期得到的数据进行方差分析和1-2α双单侧检验和90%置信区间计算,按照中国药典收载的生物等效性判断标准进行评价。3结果3.1硝苯地平回收率试验空白辅料对硝苯地平的测定无干扰。避光保存下,硝苯地平供试品溶液在48h内稳定;以峰面积对浓度作图,结果在2.0～50.0mg·L-1范围内线性关系良好。以4种不同pH释放介质分别配制的高、中、低浓度的硝苯地平溶液做回收率试验,平均回收率分别为(99.5±0.7)%(pH1.2),(99.9±0.6)%(pH4.5),(100.6±0.9)%(pH6.8)和(100.3±0.8)%(pH7.2),回收率良好。重复性试验结果良好,RSD均小于1%。3.2硝苯地平控释片释放度测定将实验结果经计算取其平均值,以累积释放百分数对时间作图,释放曲线结果见图2(自制制剂)和图3(进口制剂)。由图2,3可见,硝苯地平控释片在不同pH释放介质中的释放度基本一致。以pH6.8释放介质的释放度为对照,分别计算其他3种释放介质的释放度的相似因子f2,自制制剂分别为64(pH1.2),76(pH4.5),94(pH7.2),进口制剂分别为61(pH1.2),67(pH4.5),88(pH7.2),均大于50,表明硝苯地平控释片的释放度均不受释放介质pH的影响。对2种产品在不同释放介质中的平均释放度进行比较,f2为80,表明二者体外释放度一致。3.2.1进口制剂r分别将不同pH值释放介质中的全程体外释药数据用零级方程拟合,拟合得到相关系数r,国产制剂r分别为0.9995(pH1.2),0.9997(pH4.5),0.9993(pH6.8),0.9991(pH7.2),进口制剂r分别为0.9952(pH1.2),0.9958(pH4.5),0.9948(pH6.8),0.9954(pH7.2),均大于r临界值(P<0.01),说明本品的体外释放行为均符合零级释放特征。3.2.2不同转速下释放度对比以平均累积释放百分数对时间作图,释放曲线结果见图4(自制制剂)和图5(进口制剂)。由图4可见,在pH6.8释放介质中,硝苯地平控释片在不同转速下释放度基本一致。以转速100r·min-1为参比,分别计算其他2种转速下释放度的相似因子f2,自制制剂分别为65(50r·min-1)、74(75r·min-1),进口制剂分别为69(50r·min-1)、64(100r·min-1),均大于50,表明在所考察范围内,硝苯地平控释片的释放度均不受转速的影响。对2种产品在不同转速下平均释放度进行比较,f2为71,表明二者体外释放度一致。3.3血药浓度与标准限、回收率的关系在气相色谱条件下,硝苯地平和内标地西泮的保留时间分别为6.8min和5.9min,在所设定的测定条件下,硝苯地平和地西泮相互之间不产生干扰。见图5。将制备的线性样品按照样品处理的方法进行处理,测得峰面积。以样品峰面积与内标峰面积的比值与浓度进行加权线性回归,线性方程为Y=0.05241X-0.0346,r=0.9985(n=6,P<0.01)。由此可见,在2.10～67.3μg·L-1范围内线性关系良好。如以标准曲线最低浓度为最低定量限,血清中硝苯地平的最低定量限为2.10μg·L-1。受试者服用30mg硝苯地平后体内的最大质量浓度可以达到30μg·L-1,因此本最低定量限可以满足药动学要求并且在整个血样采集区间内,硝苯地平的浓度基本都可以测出。高、中、低3个浓度的质控样品的平均相对回收率分别为(100.2±0.4)%,(99.8±0.9)%,(101.9±2.0)%;绝对回收率(提取回收率)分别为(87.2±3.0)%,(91.1±3.4)%,(80.3±2.2)%,内标的回收率为(85.7±1.4)%;日内RSD分别为0.41%,0.87%,1.92%(n=5),日间RSD分别为0.50%,1.36%,1.41%(n=5)。样本在4℃保存,在测定周期内稳定;反复冻融2次稳定;处理后的样本在室温放置0,3h稳定;不同批配制的高、中、低的质控样本稳定。3.4曲线的变化情况24名健康受试者,13,15号受试者个别试验点超时被认为是违反试验方案没有进入最终的结果统计。交叉给予自制制剂及进口制剂后的血药浓度均值-时间曲线见图6,从图中可见2组曲线的变化趋势基本一致。单次口服30mg自制制剂及进口制剂后的主要药动学参数:t1/2β分别为(13.0±4.4)h和(12.7±4.7)h;tmax分别为(14.2±7.8)h和(16.7±7.6)h;Cmax分别为(29.3±10.2)μg·L-1和(25.6±8.1)μg·L-1;AUC0-60分别为(778.2±298.1)μg·L-1·h和(735.5±261.3)μg·L-1·h;AUC0-∞分别为(834.3±334.1)μg·L-1·h和(798.8±283.6)μg·L-1·h。3.5种制剂的响应面表1经计算自制制剂对于进口制剂的平均相对生物利用度F:F(AUC0-60)为(106.4±17.0)%,F(AUC0-∞为(105.4±18.2)%。2种制剂的Cmax、AUC0-60及AUC0-∞经对数转换后90%置信区间的计算结果:Cmax为100.6%～127.9%,AUC0-60为98.8%～111.6%,AUC0-∞为98.0%～110.0%,差异均无显著性。tmax经非参数秩和检验差异无显著性。因此2种药物制剂为生物等效性制剂。4硝苯地平控释片单剂量口服硝苯地平控释片后平均最大血药质量浓度约为30μg·L-1,因此对血药浓度测定方法的准确度、精密度和灵敏度要求更高。体外方法学研究中发现采用HPLC方法测定时最低定量限为8μg·L-1,不能满足体内测定的灵敏度要求,而且文献报道HPLC测定体内血样时结果的重复性很差,因此本实验采用GC方法测定体内血药浓度,而体外样品的测定采用了更为常规的HPLC方法。硝苯地平控释片是采用双层渗透泵技术制成的一种新型的控释片剂。其剂型特点表现为本品片芯分为两层:含药层和助推层,水分可通过半透膜进入片芯,但离子及药物不能通过此膜,服药后胃肠道水份通过半透膜进入片芯,使药层逐渐分散形成混悬液,另一侧助推层在促渗透聚合物和渗透压活性剂的作用下膨胀,推挤药物并使药物从小孔释出,从而使药物持续释放达24h。本研究表明:本品体外释放不受介质pH影响,且均符合零级动力学特征。体内血药浓度-时间曲线