高效降解氨氮的海泥酵母hn-2的筛选及生物特性研究

高效降解氨氮的海泥酵母hn-2的筛选及生物特性研究

随着我国水产养殖的精细养殖模式的发展和一体化程度的提高，水体污染日益严重。水生养殖的生态环境恶化，水质恶化已成为制约水产养殖发展的主要因素。目前，利用微生物处理水质的研究是近十年来开发的新方法。它主要集中在藻类、细菌和酶制剂的水质处理上。然而，关于真菌中酵母菌的研究和应用，尤其是在有害废水和生活污水等废水处理，很少有关于饲养水质的文章关于水质处理。海洋中的遗传环境与海洋养殖环境相似。因此，这种植物很容易适应海洋的繁殖环境，不受ph值和盐度的影响。因此，对海洋发酵母菌的处理和水产养殖水质具有很重要的现实意义。1材料和方法1.1实验材料1.1.1海水和沉积物取自湛江东海岛,海泥的取样深度为15cm,海水为离海边500m左右处.共取40个样.1.1.2培养基的制备YPD固体培养基:2%葡萄糖,2%蛋白胨,1%酵母膏,2%琼脂.YPD液体培养基:2%葡萄糖,2%蛋白胨,1%酵母膏.3%氯化钠培养基:2%葡萄糖,2%蛋白胨,1%酵母膏,2%琼脂,3%氯化钠.0.5%氯化钠培养基:2%葡萄糖,2%蛋白胨,1%酵母膏,2%琼脂,0.5%氯化钠.1%硫酸铵培养基:2%葡萄糖,2%蛋白胨,1%酵母膏,2%琼脂,1%硫酸铵.1.2实验方法1.2.1海泥酵母菌菌落的分离和分离吸取200μL海水水样,涂布到YPD固体培养基上,标记,30℃倒置培养48h,挑取疑似酵母菌的菌落进行镜检,把镜检到的酵母菌落挑取,在平板上划线,于30℃恒温培养48h,重复4～5次,直到出现纯一的菌落,保存,备用.海泥酵母菌的分离与海水类似,只是先用无菌水搅拌海泥,再取澄清水样划线分离,镜检.1.2.2计算活菌和细菌的计算1.2.3母菌的选择1.2.3.菌落在克氏原螯虾上的生长将所有分离出来的酵母菌分别划线于3%氯化钠培养基上,2d内,若菌落能将整个划线区覆盖满,则表明该菌落生长旺盛,将生长旺盛的菌落分别在0.5%氯化钠培养基上划线培养,同样把能在0.5%氯化钠培养基上生长旺盛的菌落取出来,备用.1.2.3.接种菌种的接种将所分离的酵母菌分别划线于1%硫酸铵培养基上,将生长旺盛的菌落挑选出来.取养殖海水50L,将其氨氮浓度调至为30mg/L,接种分离出来的酵母菌,对照组不加葡萄糖;依据酵母菌最适生长碳氮约比为4/1和邱德全所测养殖水体中的可溶性蛋白质和糖的含量值,在实验组中加入适量葡萄糖,使水体中碳的含量约为100mg/L,两组实验中酵母菌数量在海水中的含量均为11～18×106CFU·mL-1,其中对照组和实验组的海水不间断地充气,每隔4h取样检查,氨氮浓度用奈氏分光光度法测量,酵母活菌数量采用平板计数法.1.3.4关于hn-2细菌的生物特性的研究1.3.4.hn-2实验将酵母HN-2接种到50mLYPD液体培养基中,30℃振荡培养24h,备用;取盛有100mLYPD培养液的500mL锥形瓶3个,每个用无菌移液管加入HN-2培养液1mL,30℃振荡培养;接种后的每隔6h取样,直到48h.用平板计数法计算活菌数量,以活菌数量为纵坐标,实验时间为横坐标,做HN-2的生长曲线.1.3.4.实行不符合社会要求的产品,包括3.8种pH值不同的100mLYPD液体培养基,pH值分别是2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0;用无菌枪头从处于对数生长期的HN-2培养液中每次吸取1mL分别移入上述培养液里,30℃振荡培养24h,取样计数.1.3.4.lypd液体培养基培养将1mL菌种HN-2接于100mLYPD液体培养基,分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃振荡培养24h,取样计数.1.3.4.ypd液体培养基的制备将1mL菌种HN-2接于100mL含有NaCl的YPD液体培养基,而NaCl含量分别为0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%的100mLYPD液体培养基,接种,30℃振荡培养24h,取样计数.2结果与分析2.1分离和提取细菌经过分离与纯化得到25株酵母,其中HN代表从海泥中分离出来的酵母,HS代表从海水中分离出来的酵母.2.2降解实验结果经对分离纯化到的25株酵母菌做进一步的盐度适应、氨氮适应和氨氮降解实验,比较所实验菌种的氨氮降解能力,得到4株能高效降解氨氮的酵母菌株.对此,本实验选用编号为HN-2酵母菌做初步研究.在氨氮初始浓度为30mg/L的养殖水体中,对照组和实验组在0～8h的时间段内,水中的氨氮基本没被降解,酵母菌的数量略有下降.16h时,对照组氨氮降解率达48.2%,实验组氨氮降解率达51.3%.16～24h时,实验组氨氮降解率基本没变化,水体中酵母菌的数量基本不变,实验组在24h时氨氮降解率为97.8%,酵母菌的数量比对照组高44.8%(图1).2.3hn-2细菌的生物特征2.3.1酵母菌生长情况0～6h是HN-2的生长延滞期;在6～18h酵母菌数量迅速增加,酵母菌HN-2处于对数生长期;在18～36h时酵母HN-2处于生长稳定期,酵母菌的数量基本不变;到36h以后,HN-2已经基本停止增长,开始进入衰亡期(图2).2.3.2hn-2是哪种植物最适合生长phHN-2的最适pH值为7.0左右(图3),pH值高于9或低于3时,HN-2不生长.2.3.3生长繁殖能力在温度越高或越低的环境中,HN-2生长繁殖能力就越弱,该菌适宜在30℃左右的环境中生长,温度高于40℃时,HN-2基本停止生长(图4).2.3.4盐度对酵母hn-2生长的影响在(0～3)%盐度内,酵母HN-2的数量基本没有什么差别,HN-2的生长能力基本上不受盐度的影响,但盐度高于3%时,酵母HN-2数量随着盐度的升高而减少,盐度为6%以上时,酵母HN-2基本不生长(图5).3讨论3.1水中氨氮、葡萄糖和葡萄糖对废水的降解率相对于细菌或真菌来讲,由于养殖水体中的营养不均衡,这样它们一般难以快速繁殖,从而影响它们去除水体氨氮的效果.因此,本实验研究了C/N对酵母菌氨氮降解的影响.在氨氮初始浓度为30mg/L的养殖水体中,对照组在0～8h的时间段内,由于生长环境的改变,导致部分酵母菌死亡.酵母HN-2也要经历生长延滞期,其生长活力不高,因此,水中的氨氮基本没被降解,但从8h后,酵母菌HN-2适应生长环境,其繁殖速度加快,利用水中氮源速度加快,相应地降解氨氮的速度也加快,到16h时氨氮降解率达48.2%,但16～24h时,氨氮降解率基本没变化,这可能是由于前期水中碳源已被酵母菌所消耗掉或碳源与氮源的比例远低于其正常生长所需要的比例,从而限制了酵母的生长繁殖.因此,16～24h内,水体中酵母菌的数量基本不变.这与Burford等的研究结果相似,认为C/N低于微生物生长的最适比例,不利于微生物的正常生长.在养殖水体中加入少量葡萄糖,发现在16h时氨氮降解率达51.3%,之后氨氮降解率不断升高,24h时氨氮降解率为97.8%.LiuF等也利用枯草芽孢杆菌处理养殖废水时发现,碳的缺乏可能限制细菌的生长和氨氮的去除率,并在加入一定量的葡萄糖后使氨氮的去除率大大增加.因此,邱德全等认为适当地加入碳源物质有利于提高微生物制剂对养殖水体的处理效果.但向水体中直接投入糖类物质时,可能会引起微生物的快速繁殖导致水体的溶氧缺乏,所以采取这一措施时应特别小心.3.2ph值对hn-2和酵母菌生长的影