北极冰雪海泥中16srdna冷适应细菌的分离及低温酶检测

北极冰雪海泥中16srdna冷适应细菌的分离及低温酶检测

冷适应微生物的资源丰富。近年来，欧洲、美国和日本的科学家在应用于极微生物的潜在应用方面做了大量工作，取得了很大进展。中国在这一方向上的研究相对缓慢。应用低温微生物具有以下优势:有利于防止微生物污染,尤其是在连续运转系统中同源的中温酶不活泼;经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失,而且低温或适温处理不会影响产品的品质。对北极海泥菌群的初步鉴定及研究,以期为国内冷适应微生物资源开发利用提供部分参考。1材料和方法1.1中心惠赠与表采集自北极海域的海洋沉积物样品,由中国极地研究中心惠赠:B12(2024m)、N01(3333m)、P23(2028m)、R15(1732m)、P37(2216m)。1.2水、海水、ph2216E海洋细菌培养基:蛋白胨5g、酵母粉1g、柠檬酸铁0.1g、琼脂18g、陈海水1000mL、pH8。将5个海泥样品稀释后涂布在2216E培养基上,4℃倒置培养7d左右挑取形态不同的单菌落,在2216E培养基上纯化后得到8株菌,保种转入-80℃保存。1.3菌株16srdna分析1.3.1形态观察和生理生化试验菌株的生理生化特征根据伯杰氏细菌鉴定手册进行。1.3.2温度生长试验将8株菌接入2216E培养基分别放到4℃、15℃、28℃培养箱培养10d左右,观察生长状况(表1)。冷适应微生物根据其生长温度特性可细分为两类,一类是必须生活在低温条件下且其最高生长温度不超过20℃、最适生长温度在巧15℃、在0℃可生长繁殖的微生物称嗜冷菌;另一类其最高生长温度高于20℃、最适温度高于15℃、在0-5℃可生长繁殖的微生物称为耐冷菌。根据此为判断依据:N011、P371、P372为耐冷菌,P231、R151、R152、N013、N014为嗜冷菌。1.3.4基因组DNA的提取和16SrDNA系统发育分析提取细菌染色体DNA,菌株16SrDNA序列PCR扩增参照文献进行。扩增16SrDNA的正向引物为27F:5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′(对应于E.coil16SrDNA序列的第8-27个碱基位置),反向引物1492R:5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′(对应于E.coli16SrDNA的第1492-1510个碱基位置)。100μL的PCR反应体系:1×PCR缓冲液,1.5mmol/LMgC12,4×dNTP混合物各200μmol/L,引物各0.5μmol/L,TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL),2μLDNA原液。PCR反应条件:96℃预变性6min;94℃变性1min,50℃复性lmin,72℃延伸2min,30个循环;最后72℃温育6min。PCR扩增产物经电泳检测后,直接交由上海生工生物工程技术公司进行纯化和序列测定。将测定的基因序列输入GenBank,获得收录号。并运用Blast程序与数据库中已存在的细菌16SrDNA核酸序列进行相似性比较分析。序列的比较采用MEGA(4.0)软件,用Neighbor-Joining法得到系统进化发育树。2结果与分析2.1低温酶生理生化试验结果表明,细菌生活在高盐高辐射的南极,其耐盐的能力强,并且有多株细菌产低温酶类:N014产淀粉酶,R151产明胶酶,P371产纤维素酶(表2)。2.2srda序列的同源性5株嗜冷菌经PCR测序分别获得部分序列:P231(910bp)、R151(888bp)、R152(909bp)、N013(893bp)、N014(896bp)。通过与GenBank核酸序列库中的序列进行局部同源性比较(BLAST),结果表明,P231与Colwelliarossensis的16SrDNA序列有较高的同源性,其中与Colwelliasp.EM0379有98.8%的同源性;R151与Psychrobacterfrigidicola的16SrDNA序列有较高的同源性,其中与Psychrobactercellerstrain23有98.9%的同源性;R152与Marinobacterguineae的16SrDNA序列有较高的同源性,其中与Marinobactersp.BSi20018有99.2%的同源性;N013与Pibocellaponti的16SrDNA序列有较高的同源性,其中与Pibocellasp.MOLA312有99.7%的同源性;N014与Marinobactersegnicrescens的16SrDNA序列有较高的同源性,其中与Marinobactersp.ANT8277有99.2%的同源性。一般认为,16SrDNA序列同源性大于99%,可以认为属于同一个种;16SrDNA序列同源性小于98%,可以认为属于不同的种;同源性小于95%,可以认为属于不同的属。通过构建五株嗜冷菌的进化树可以确定P231属于科尔维尔氏菌属(Colwellia)(图1)、R151属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)(图2)、R152属于海杆菌属(Marinobacter)(图3)、N013属于极地杆菌属(Pibocella)(图4)、N014属于海杆菌属(Marinobacter)(图5)。3淀粉酶的产酶系统成分冷适应细菌由于生活环境的特殊-低温高盐,所产酶在较低温度时具有较高的活性,由于反应温度较低,不但在低温条件下可以高效反应,而且在生产工艺中可以通过较低温度的热处理使酶失活,节约能量与费用,成为人们研究开发的热点。近年来对于低温酶结构方面的研究普遍认为低温酶的结构柔韧性强和分子表面的离子对含量少是其能在低温维持高活性的主要原因。淀粉酶在食品、医药、洗涤、造纸、纺织方面有着非常广泛的应用前景,酶在较低温度具有较高活性,具有开发的现实意义。明胶酶在肿瘤抑制、脱色工艺上有着良好作用,纤维素