热敏灸治疗抑郁症大鼠模型的制备及研究

热敏灸治疗抑郁症大鼠模型的制备及研究

抑郁是精神病领域的常见疾病。该病以抑郁为主要症状，伴有思维障碍和意愿活动，即认知障碍。据世界卫生组织统计,全球抑郁症发病率约为11%,已成为世界第四大疾病,预计到2020年可能成为仅次于心血管疾病的人类第二大疾病。在发病年龄上,各年龄层次均可患病,且女性多于男性。抑郁症的高发病率对家庭及社会带来极大的危害。然而其发病机制尚未完全阐明。临床观察到某些内分泌疾病如甲状腺功能低下、柯兴氏综合征等有明显抑郁症状,即肾上腺和甲状腺功能障碍可能与抑郁症的发生有关。随着抑郁症发病机理的深入研究,当前研究认为下丘脑-腺垂体-性腺轴(HPG)功能紊乱与抑郁症状产生也有密切关系。目前临床上针对抑郁症的某一事实,采取调整体内内分泌激素的水平如补充雌激素或补充甲状腺激素治疗抑郁症,也能起到一定的治疗效果,但其产生的副作用也是一个不容忽视的事实,如雌激素治疗产生子宫内膜癌等。祖国医学的艾灸疗法治疗抑郁症具有一定的效果。艾灸法,是借助艾草燃烧时发出的药力和红外线温热刺激,来熏灼特定的穴位,通过调和气血、疏通经络,从整体上调节脏腑功能,以达到治病防病的目的。该疗法操作简便,疗效显著,无任何副作用,正日益受到患者的青睐。刘瑶观察艾灸“百会”和抗抑郁药治疗抑郁症,与治疗前相比,两者均取得了明显疗效,但艾灸疗法无副作用。而腧穴热敏化艾灸新疗法的出现,则大幅度提高了艾灸临床疗效。临床研究表明,热敏灸治疗多种疾病具有良好的疗效,其防治抑郁症也取得了一定的疗效。然而,热敏灸治疗抑郁症的作用机理还尚不清楚。因此,本文采用雌性SD大鼠,联合孤养和慢性不可预见性的温和应激(CUMS)制备抑郁症大鼠模型,采用行为学测试和放射免疫分析法(RIA)等研究热敏灸“百会”对模型大鼠行为学和内分泌激素水平等方面的影响,观察热敏灸防治抑郁症的效应,阐明热敏灸防治抑郁症的作用机理,为热敏灸防治抑郁症提供理论依据,促进热敏灸在抑郁症临床防治中的作用。1材料表面1.1动物和食物1.2仪器、试剂和试剂Leica2000生物显微镜及图像分析系统(德国);TDL80-2B台式离心机(上海安亭科技仪器厂);HH·W21-420S数显电热恒温水温箱(上海跃进医疗器械有限公司);RT6000酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司);RT3000全自动洗板机(深圳雷杜生命科学股份有限公司);甲状腺素(T4)放射免疫分析试剂盒(潍坊三维生物工程集团有限公司);雌二醇(E2)放射免疫分析试剂盒(潍坊三维生物工程集团有限公司);大鼠皮质酮(corticosterone)ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)等。2大鼠一般情况测试2.1抑郁症动物模型制备采用CUMS制备抑郁症大鼠模型,根据文献报道进行操作,即对B、C、D组大鼠,每周随机给予禁食、禁水、昼夜颠倒、冰水游泳(4℃)、夹尾、电击、水平振激等刺激,每日采取1种方法刺激,连续21d。2.2艾灸取穴与方法在给予大鼠21dCUMS,即抑郁症模型造成之后,将C、D两组大鼠头部的毛发剪去,露出“百会”穴,作为艾灸穴位。用直径0.4cm,长10cm的艾条(江西中医学院附属医院制),距穴位2cm左右温和灸大鼠,1次/d,C组15min/次,D组40min/次,共14d。2.3大鼠行为学测试2.3.1Open-Field测试于应激前1天、应激1周、2周、3周及治疗1周、2周时,用自制的敞箱进行测试。以大鼠穿越的格子数作为水平活动得分(crossing),穿越1格为1分,如动物沿线行走,每10cm为1分;以直立次数为垂直活动得分(rearing),以双前肢离地为1分。每只动物测试1次,3min/次。敞箱测试中的水平活动得分反映大鼠的活动度,垂直活动得分反映大鼠对周围事物的兴趣高低。2.3.2蔗糖水摄入量测试于应激1天、应激1周、2周、3周及治疗1周、2周时进行测试。各组动物同时放入饮用水和1%的蔗糖水,1h后称量各只大鼠的饮用水量及蔗糖水消耗量,计算糖水消耗百分比。糖水消耗实验反映大鼠对奖赏的快感反应。2.4大鼠动情周期观察于艾灸治疗两周后连续5d进行观察。方法:用滴管吸取生理盐水于大鼠阴道内反复抽吸3~5次,抽取分泌物涂于玻片上,待其干燥后染色镜检。2.5血清雌二醇(E2)、甲状腺素(T4)和皮质酮(COR)水平测定大鼠用3%戊巴比妥钠(30~40mg/kg)腹腔注射麻醉后,抽取腹主动脉血6ml置于离心管,然后以2500r/min的速度离心15min,收集血清,用于检测E2、T4和皮质酮的水平。E2、T4采用RIA进行测定,皮质酮采用ELISA进行测定。2.6统计学处理采用完全随机设计方法,以x珋±s表示。计量指标满足条件用方差分析进行检验,用统计软件SPSS11.0进行检验,以P﹤0.05作为显著性差异的标准。3热敏充充大鼠评估抑郁症大鼠血糖的变化3.1热敏灸对抑郁症大鼠Open-Field测试结果的影响结果见表1。从实验统计数据可以看出,适应期间,各组大鼠敞箱测试结果之间无显著差异;随着时间的延长,各组大鼠直立活动得分和水平活动得分均有所减少。应激1周、2周、3周时,与正常组相比,模型组、艾灸组、热敏灸组大鼠各活动得分均减少,尤其是直立活动得分明显减少,具有统计学的差异。艾灸治疗期间,模型组大鼠的水平活动得分和直立活动得分低于正常组,而艾灸组和热敏灸组大鼠均高于模型组。3.2热敏灸对抑郁症大鼠糖水消耗量的影响结果见表2。从表2中可以看出,应激前1d,各组大鼠糖水消耗百分比均比较接近;自应激开始后,正常组大鼠糖水消耗百分比逐渐增加,而模型组、艾灸组、热敏灸组大鼠增加缓慢,甚至出现倒退现象;艾灸治疗期间,正常组大鼠对糖水的摄入量继续保持增长的趋势,模型组大鼠对糖水的摄入量呈下降趋势,而艾灸组和热敏灸组大鼠在治疗一段时间后,摄入量缓慢上升,虽然和正常组相比较有显著差异(P﹤0.05),但其增长趋势还是较明显。3.3热敏灸对抑郁症大鼠动情周期的影响雌性大鼠为全年多发情动物,其性周期4~5d,分为动情前期、动情期、动情后期和间情期,在性周期不同阶段,阴道粘膜可发生典型变化,通过做阴道涂片观察,可以推测雌性大鼠处于性周期的哪一阶段。本实验观察到:在连续5d的涂片中,正常组大鼠可观察到规律的动情周期;模型组出现无规律的动情周期;艾灸组和热敏灸组可见较规律的动情周期。见图1。3.4热敏灸对抑郁症大鼠血清E2、T4和皮质酮水平的影响结果见表3。从表3中可以看出,与正常组大鼠相比,模型组大鼠血清E2水平低于正常组大鼠(P<0.05),血清皮质酮水平则明显高于正常组大鼠(P<0.01),而T4水平与正常组无明显差别;与模型组大鼠相比,艾灸组、热敏灸组大鼠血清E2水平有所上升,血清皮质酮水平则组有所下降,而对血清T4水平影响不大。4治疗抑郁症的热敏充分效果有关抑郁症的动物模型研究非常多,可分为应激模型、孤养模型、药理学模型、嗅结节切除模型等,其中Willner等建立的CUMS是目前应用较多的模型之一,故本实验采用CUMS制备大鼠抑郁症模型。根据Willner理论,以快感缺乏作为抑郁症模型成功的指标。本实验观察到:在给予21dCUMS后,B、C、D组大鼠水平活动得分和直立活动得分均减少;糖水消耗百分比降低,即活动度降低,兴趣度下降,对奖赏的反应性下降。上述结果提示:给予CUMS21d后,动物表现出的抑郁状态、兴趣丧失、快感缺乏,与抑郁症的临床表现有一定程度的相似性。因而认为抑郁症模型制备成功。中医学认为,脑为元神之府,抑郁症的病位在脑,可通过治理督脉为主来调节脑神,从而治疗抑郁症。《难经·二十八难》曰:“督脉者,起于下极之俞,并于脊里,上至风府,入络于脑。”督脉为阳脉之海,总督一身之阳气,统领诸经,进而联系五脏六腑,对各经脉脏腑病变均有调节作用。百会为手足三阳经与督脉及足厥阴肝经之会,位居于巅顶,犹天之极星居此,为百脉聚汇之处,可调补中气,健脑宁神,是宁心调神之要穴。为此,我们观察热敏灸大鼠“百会”对抑郁症的治疗效果。热敏灸,通俗地说就是在热敏化腧穴上进行艾灸。临床观察表明,人体腧穴存在敏化态与静息态两种功能态,当人体发生疾病时能使体表腧穴发生敏化,敏化的类型多种多样,而腧穴热敏化是经穴敏化的一种新类型,处在热敏态的腧穴对热刺激特别敏感,能耐受较长时间(平均为40min左右)的热刺激并且感到很舒适,而传统悬灸的灸量每次每穴一般从10min到15min,或者以局部皮肤潮红为度,往往达不到治疗个体化的最佳灸量。可见,与传统的悬灸相比,热敏灸的灸量不同。灸量即艾灸的每次有效作用剂量。艾灸剂量由艾灸强度、艾灸面积、艾灸时间三个因素组成,在前两个因素基本不变的情况下,艾灸剂量主要由艾灸时间所决定。本研究观察到:艾灸“百会”15min(传统悬灸)和艾灸“百会”40min(热敏灸)均能增加大鼠Open-Field测试中的水平活动得分和直立活动得分,提高糖水消耗百分比,显示传统灸和热敏灸具有增加大鼠活动度,提高大鼠对周围环境兴趣的作用,表明传统灸和热敏灸均具有改善抑郁症的效果。然而它们治疗抑郁症的机理还不完全清楚。流行病学资料统计结果表明,世界范围内女性抑郁症的发生率是男性的2倍,女性在绝经期、月经期和分娩期等时期易发生抑郁症。众所周知,雌激素对调节情绪有多重影响。雌激素抗抑郁症作用的可能机理有:雌激素与神经递质和中枢神经系统的相互作用。雌激素与中枢神经系统的结构和功能活性有关,即雌激素可以促进神经元生长,阻止神经元细胞萎缩,调节突触的可塑性;雌激素可选择性增强5-羟色胺递质系统的效应,通过增加中脑中缝核雌激素β受体数量,调节5-羟色胺(5-HT)生物合成酶的表达,增加5-HT含量及突触后5-HT的效应,等等。而皮质酮则有可能直接导致5-HT等神经递质含量降低。由此可见,体内内分泌激素水平紊乱可通过影响神经递质(如5-HT)的合成和代谢,导致抑郁症的发生与发展,而调整体内内分泌激素的水平如补充雌激素等能起到一定的抗抑郁效果。本实验结果显示,模型组大鼠血清E2水平低于正常组大鼠,而血清皮质酮水平则明显高于正常组大鼠,与上述研究结果[1~3]基本一致。至于抑郁症血清皮质酮水平增高,推测可能是由于各种应激刺激作用于机体后,机体出现应激反应,出现以下丘脑-垂体-肾上腺功能增强为主的反应,造成体内皮质酮含量增加;而抑郁症模型体内出现雌激素水平低下则可能是由于体内增加的皮质酮继而引起下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)功能抑制,导致雌激素水平降低。而艾灸和热敏灸可提高大鼠血清E2水平,降低血清皮质酮水平,以热敏灸调节效果更为明显。提示热敏灸“百会”可能通过打开机体控制系统的开关,发挥调节大鼠体内内分泌激素的水平,从而达到减轻或缓解抑郁症。SD大鼠27只,雌性,2~3月龄,由江西中医学院实验动物中心提供,合格证编号:JZDWNo.2011-0074。适应性喂养1周后,采用随机数字表将大鼠分为正常组(A组,6只)、模型组(B组,7只)、艾灸组