北极海泥中抗菌活性海洋真菌的筛选与初步鉴定

北极海泥中抗菌活性海洋真菌的筛选与初步鉴定

从海洋微生物中寻找草药已成为开发药物资源的重要策略之一。国内外对海洋细菌和放线菌的活性天然产物的研究起步较早,发现的新化合物数量也较多,相比之下对海洋真菌的系统研究起步较迟,直到20世纪90年代才进入较快速的发展阶段。目前,人们已经从海洋真菌的发酵产物中发现了1000多种新的次生代谢产物,这些代谢产物呈现出良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性,成为当前海洋药物研究的热点。作者从北极海泥中分离真菌,采用其发酵液进行抗菌活性筛选,并鉴定其种类、研究其活性代谢产物的性质,以期发现具有显著抗菌活性的菌株,为建设海洋真菌种质资源库、开发新的微生物药物奠定基础。1实验1.1材料表面1.1.1样本来源北极海泥来自北极黄河站附近海域潮间带。1.1.2菌株来源atcc金黄色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)ATCC25925、大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922、多株金黄色葡萄球菌临床分离耐药菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans),均由中国药科大学微生物学实验室提供。1.1.3主试剂DNAMarker、TaqMasterMix,康为;引物由上海生工合成;其它试剂均为国产分析纯。1.2培养基1.2.1培养基的制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯去皮,200g切成小块,加水煮沸30min,4～6层纱布过滤,加20g葡萄糖、20g海盐、15～20g琼脂,蒸馏水1000mL。察氏培养基:NaNO32g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,蔗糖30g,海盐20g,琼脂15～20g,蒸馏水1000mL。沙氏培养基:蛋白胨10g,葡萄糖4g,琼脂15～20g,蒸馏水1000mL。改良的马丁培养基:葡萄糖20g,蛋白胨5g,酵母粉2g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.5g,海盐20g,琼脂15～20g,蒸馏水1000mL。葡萄糖酵母膏蛋白胨琼脂培养基:葡萄糖10g,蛋白胨2g,酵母膏0.5g,海盐20g,琼脂15～20g,蒸馏水1000mL。1.2.2指示器菌的培养基营养琼脂培养基:蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂15～20g,蒸馏水1000mL。1.2.3发酵培养基种子发酵培养基:马铃薯葡萄糖液体培养基。发酵培养基:察氏液体培养基。1.3方法1.3.1菌落纯化和纯化采用平板稀释法分离菌株。取海泥样品1g,用无菌海水逐级稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5数量级,各取0.2mL均匀涂布于分离平板上,每个稀释度涂3个平板,28℃倒置培养,每天观察是否有新菌落出现,挑取形态相异的菌落划线纯化,纯化的菌株斜面置于4℃冰箱保存。1.3.2种子培养从活化斜面中取菌丝块或孢子接种于装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中,28℃、200r·min-1下培养3d作为种子。将种子以8%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中,28℃、200r·min-1下培养7d。将发酵液用低温高速离心机8000r·min-1离心20min,取上清布氏漏斗抽滤,得到澄清发酵液,用无菌的0.22μm滤膜过滤,得无菌体的澄清发酵液,4℃冰箱保存。1.3.3抑菌圈的测定采用滤纸片法进行抗菌实验。用无菌水将斜面培养的指示菌洗下,与适量培养基混匀倒平板,将含有待测样品的无菌滤纸片贴于平板上,细菌培养24h,真菌培养48h,观察是否有清晰透明的抑菌圈产生,并测量抑菌圈的直径大小。1.3.45、细菌的识别1.3.4.1.培训的特点采用标准条件培养菌株,观察并记录PDA平皿菌落特征,包括菌落的正背面颜色、菌落直径、菌落质地、有无分泌物等。1.3.4.2.微观形态观察挑取菌株产孢器及菌丝制成水封片,吕氏碱性美蓝染色,进行镜下观察,记录菌丝特征及分枝情况、孢子和产孢器结构等。1.3.4.pcr和测序采用改良的CTAB法提取基因组DNA。ITS序列的PCR扩增采用通用引物:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR扩增条件:95℃预变性4min,95℃30s,55℃40s,72℃1min,循环30次,72℃延伸8min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测,纯化后交南京思普金公司测序。将测序得到的ITS序列通过Blast与GenBank中的核酸序列进行比对,利用BioEdit7.0.9.0及Mega5.0软件进行系统发育分析。采用邻接法(Neighborjoiningmethod)构建系统发育树,并对所构建的系统发育树进行自举分析(Bootstrap),Bootstrap检验值≥50%(1000次重复),估算其内分支的支持率。1.3.5在菌株h下发酵溶液中测定抗菌活性物质的物理和化学性质1.3.5.体外抑菌活性测定将发酵液12等分,分别调pH值至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,再将各份5等分,分别置于4℃、40℃、60℃、80℃及100℃水浴1h,各样品以不同pH值水溶液和原发酵液为对照进行体外抗菌实验,观察抑菌效果。1.3.5.有机相的抑菌活性测定将发酵液12等分,分别调pH值至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,再将各份6等分,分别加入等体积的乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸丁酯、石油醚及正丁醇,4℃静置,待完全分层后分别取有机相和水相,水相将pH值调回中性后同有机相均以原发酵液为对照进行抑菌实验,观察抑菌效果。1.3.6脱盐粗提物的制备将发酵液调pH值2.0,过滤,除去不溶性杂质,然后过已预处理的大孔离子交换树脂D380,去除大部分色素及杂质,收集洗涤液,接着用大孔吸附树脂HPD300吸附,再用50%乙醇洗脱,分部收集洗涤液、洗脱液,测定不同洗涤液、洗脱液的活性,将有活性的部分合并,减压浓缩成膏状物,即得活性物质的脱盐粗提物。1.3.7不同化合物显色研究将粗提物溶于少量甲醇中,在硅胶G板(20cm×15cm)上点样,筛选后选用正己烷-正丁醇(4∶1)为展开剂,展层后干燥,在245nm的紫外灯下观察,并用10%硫酸乙醇溶液喷雾显色。2结果与讨论2.1菌株抗菌活性的比较本实验选用添加链霉素的5种不同的培养基从北极海泥样品中共分离得到17株真菌。对这17株真菌的发酵产物进行抗菌活性初步筛选,结果发现菌株H5、H6对一种或几种指示菌有抗菌活性。其抑制6种指示菌的能力比较见表1。从表1可以看出,菌株H5的抗菌活性较强且抗菌谱较广,且对多株金黄色葡萄球菌临床分离耐药菌有较好的抑制作用,因此选取H5进行后续研究。2.25年的诊断结果2.2.1菌落形态、形态菌株H5在PDA平板上生长速度较快,培养7d后,菌丝蔓延至整个平板;菌落中心灰蓝色,外缘白色,反面鲜黄色;菌落呈圆形,正面扁平且中心略微突起,边缘呈树枝状,产鲜黄色色素;质地疏松,绒毛状,无明显纹饰(图1)。生物电镜下观察菌丝具横隔,无分枝;分生孢子梗顶端膨大成为顶囊,呈半球形,顶端着生成串的球形分生孢子(图2)。根据其形态特征初步鉴定为烟曲霉属(Aspergillusfumigatus)。2.2.2系统发育树检测PCR扩增得到的菌株H5的ITS序列全长为557bp。将该序列与GenBank数据库中的真菌ITS序列进行Blast分析,结果表明,菌株H5的ITS序列与烟曲霉属的菌株相似度较高,系统发育树见图3。由图3可知,菌株H5与烟曲霉属Aspergillusfumigatusisolate13-F2处于同一分支,亲缘关系最近,同源性达到99%,因此可以确定菌株H5属于烟曲霉属。2.3在微生物h发育液中，抗菌活性物质的物理和化学性质2.3.1不同ph值对抗菌活性的影响由图4可知,菌株H5发酵液在酸性至中性条件下抗菌活性较高且性质较稳定(不同pH值水溶液、对照均无抑菌圈形成,排除因pH值不同对实验结果造成干扰的可能)。pH值1～5的发酵液沸水浴lh后抗菌活性几乎不变。但在碱性条件下其抗菌活性明显减弱,pH>8时丧失抗菌活性,表明抗菌物质可能在碱性条件下被破坏。2.3.2有机溶剂萃取通过观察萃取后各样品形成的抑菌圈的大小,发现菌株H5的发酵液只有在酸性至中性条件下才能被有机溶剂萃取,在乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸丁酯、石油醚、正丁醇萃取液中有不同浓度活性物质存在(见图5),正丁醇的萃取效果相对最好,说明活性物质极性较大。2.4液喷雾显色观察发酵液的粗提物经硅胶G薄层层析后,通过10%硫酸乙醇溶液喷雾显色可观察到4个斑点。经活性检测后发现其中1个斑点(Rf=0.4)具有较强的抗菌活性,且与其它斑点之间的分离度良好(表2),为后续分离纯化工艺奠定了基础。3菌株的活性成分从北极海泥中分离筛选抗菌活性海洋真菌,共分离得到真菌17株,其中菌株H5、H6的发酵液具有较好的抗菌活性,菌株H5的活性更强。根据菌株的形态学特征和ITS序列分析结果,鉴定菌株H5属烟曲霉属(Aspergillusfumiga