基于bcs-rolox法的滩涂海泥水溶体系抗氧化性能研究

基于bcs-rolox法的滩涂海泥水溶体系抗氧化性能研究

海泥属于矿渣。根据现代研究，海污泥具有丰富的矿物、胶体成分、独特的海洋微生物、维生素、氨基酸和抗生素等。其丰富的营养活性成分是一般化妆品基料所不具备的,它们具有促进皮肤新陈代谢、增强皮肤营养、保持皮肤弹性、延缓皮肤衰老的作用。浙江秀山滩涂海泥集东海生态环境和钱塘江冲积之精华,天然、洁净、细腻,富含多种对人体皮肤有益的Ca,Fe,Zn,Se,Mg,Sr,Ge和VA,VE,VC及氨基酸等天然物质,滩涂海泥中含有的水藻类、水草和甲壳类等动植物残骸,经过多年淤积,已形成对人体皮肤有益的活性蛋白质和多糖等有机物质。这些特点正是海泥提取液具有抗氧化性能和美白功效的基础。作者对秀山海泥水溶体系的抗氧化性能和美白功效的影响因子进行了研究,探讨了海泥水溶体系具有最佳美容功效的条件,旨在为秀山海泥的精深加工利用提供理论依据。1实验部分1.1样品位置样品海泥采自浙江秀山乡滩涂,在滩涂的起始位置,按高、中、低潮位各取一点,合并三点的泥样作为此位置的样品。然后每隔200m取1次样,共取5次,均匀混合5个样品为待试样品,其中水分的质量分数为50%。1.2仪器、试剂与仪器Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchrom-2-carboxylicacid,VE的一种水溶性类似物)、L-酪氨酸、熊果苷、蘑菇酪氨酸酶,均购自Sigma公司;BCS(BathocuprionedisulfonateAcid,2,9-dimethyl-4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolinedisulfonic),购自Fluka公司;其他均为国产分析纯商品试剂。BCS用40%(质量分数)乙醇溶液配制,Trolox用80%(质量分数)乙醇溶液配制,置于4℃冰箱冷藏备用;其他无特别说明的溶液均为双蒸水配制。DELTA320pH计,梅特勒-托利多公司;UV-2102紫外/可见分光光度计,上海尤尼柯仪器有限公司;GL-16G-Ⅱ高速台式离心机,上海安亭科学仪器厂;DHG-9070AS新型电热干燥箱,宁波江南仪器厂;ZHJH-1109垂直流超净工作台,上海智城分析仪器制造有限公司。1.32海洋污泥水溶系统的准备1.3.1预处理法海泥→加蒸馏水搅拌(m(海泥)∶m(H2O)=1∶3,室温,pH=7)→泥浆水过筛(800目)→离心(8000r/min,10min)→收集湿泥→干燥→粉碎过筛(800目)→海泥干粉(w(水)<5%)。1.3.2海泥水溶体系的制备取10g海泥干粉溶于一定温度一定pH的50mL双蒸水中(用标准NaOH溶液或盐酸调pH),溶解提取一定的时间后,经搅拌、混匀、一定的转速离心处理后取澄清液,沉淀加适量水重复处理3次,合并3次澄清液定容至250mL,减压旋转蒸发至100mL,制得海泥水溶体系,待测。该体系中的有效成分一般应包括氨基酸、蛋白质、糖类、水溶性生物碱、胺类、鞣质、苷类、无机盐等。1.4抗衰老是一个重要表征作者把海泥应用于美容护肤品的功效定位在抗衰老,而抗衰老的两个重要表征就是抗氧化和美白。作者结合生产实际,确定了适合一般工厂实验室条件的简单、有效、快速的测评方法。1.4.1抗氧化性吸收剂的改进采用BCS-Trolox法测定样品的总抗氧化性能,其原理是利用Cu2+被样品中的抗氧化物质还原为Cu+形式,新生成的Cu+能够与bathocuproine(BC)结合生成有色络合物,可以稳定存在且在480nm～490nm处有最大吸收峰,根据吸光度值可以计算样品的抗氧化性值。作者在此基础上进行改进,采用BC的类似物BCS(BathocuprionedisulfonateAcid)作为Cu+的特定鳌合剂,结合生成桔黄色络合物,在480nm处有最大吸收峰。每份样品设置双管同时检测,双管值差应<0.5%。1.4.2苷抑制率采用酪氨酸酶体外评价法,选用熊果苷作为标准对照品,在阳性对照吸光度值为0.325的条件下测得的熊果苷抑制率为参比对照标准值。每份样品设置双管同时检测,双管值差应<0.5%。样品对酪氨酸酶活性的抑制强度以相对于熊果苷的抑制率表示,按以下公式计算:抑制率=[(A1-AS)/(A1-AC)]×100%式中A1,AC和AS分别为阳性对照,标准对照和样品的吸光度值,抑制率高表明其对酶活性抑制强度高。2结果与讨论2.1海泥提取液与温度的关系分别在浸提温度为25℃,35℃,45℃,55℃,65℃,75℃和85℃下制得海泥水溶体系,进行抗氧化及美白功效评价。测定时以样品10mL分别取代各组标准物Trolox和熊果苷,配制和检测方法见参考文献,结果如图1。由图1可知,随着温度上升,海泥提取液的吸光度值也随着增大,并在65℃条件下海泥提取液有最大的吸光度值,然后随着温度的继续升高,吸光度值反而下降,并趋于平衡。这可能是由于海泥中的活性成分在65℃时溶解度最大,但是随着温度的升高,部分活性物质开始分解或变异,降低或失去了其还原活性。由图1还可知,随着温度上升,海泥提取液的酪氨酸酶抑制率也随着增大,并在45℃条件下达到最大,然后随着温度的升高,抑制率反而下降,并趋于平衡。这可能是活性成分在45℃时溶解充分,而随着温度的升高,引起活性物质的分解或变异,减弱或失去了其抑制酶的作用。2.2抗氧化及美白功效评价分别在提取时间为5min,10min,20min,30min,60min和120min下制得海泥水溶体系,进行抗氧化及美白功效评价。测定时以样品10mL取代各组标准物,配制和检测方法同上,结果如图2。由图2可知,体系在反应20min时吸光度值和酶的抑制率均达到最大,并随着时间的延长均呈现明显下降的趋势,在60min后趋于平缓。说明随着提取时间的增加,海泥水溶体系的抗氧化活性降低,底物与酪氨酸酶的结合能力逐渐减弱,导致对酶的抑制活性下降。2.3氧化态酶的生成其基因连锁的cuh+抗氧化功效评价方法中利用了Cu2+被样品中的抗氧化物质还原为Cu+这一反应,Cu2+的存在决定了水溶体系pH不能过大,所以在选择pH梯度时必须考虑这一点。因此,分别在pH=3～9时,制备海泥水溶体系并进行功效评价,结果如图3。由图3可知,海泥水溶体系的吸光度值随着pH的增加先上升、后降低、之后又上升。抗氧化体系的显色原理是Cu+与BCS的络合物的生成,随着反应体系pH的增大,Cu2+易生成Cu(OH)2沉淀,难以还原为Cu+,从而阻止了显色络合物的形成;当pH进一步增加时,Cu(OH)2因转化成[Cu(OH)4]2-而溶解,配合物可与体系中的还原物质反应而生成Cu+,但反应程度低于酸性条件,因此,虽然吸光度有所回升,但明显低于酸性条件下的吸光度。所以制备海泥水溶体系时,pH不宜过高。酪氨酸酶的作用过程为氧化态酶(Eoxy)与单酚(M)的非共价结合,单酚(M)上的羟基被亲核进攻释放出H+,生成EoxyM复合物。作为底物的酚或酚盐进攻酶复合物,使EoxyM进行羟基化,生成EmetD复合物,并进一步分解成醌(Q)、H2O和脱氧态酶(Edeoxy),所以根据反应动力学原理,H+的存在能促使Eoxy转化为EoxyM,所以对酪氨酸酶的抑制作用随着pH的增加而增加。由图3可知,当pH>7,抑制作用趋于平缓。2.4n7.2试验结果在其他因素确定的条件下考察了离心转速对抗氧化和美白功效的影响,转速选择为3000r/min,5000r/min,7000r/min,9000r/min,11000r/min和12000r/min,结果如图4。由图4可知,随着转速的提高吸光度值和酶的抑制率均逐渐增大,在9000r/min时功效均最强,之后随着转速的增加抗氧化功效逐渐下降,而对酶的抑制率无明显的影响,因此制备海泥水溶体系时,离心转速确定为9000r/min。2.5正交试验结果在单因素分析的基础上,固定离心转速为9000r/min,分别选取温度(θ/℃,A)、pH(B)、提取时间(t/min,C)作为海泥水溶体系抗氧化性能的影响因子进行考察,试验安排及结果见表1,方差分析结果见表2。通过对正交试验的结果分析,可以看出对海泥水溶体系抗氧化性能的影响因素主次顺序为:A>C>B。由表1可以得到海泥水溶体系抗氧化性能最强的制备条件为A3B2C1,即温度75℃,pH=5,时间10min。对结果进行方差分析,由表2可知,因素A的影响最显著,因素B和因素C影响很小,与极差分析及实际操作结果一致。2.6海泥水溶体系美白功效配方正交试验在单因素分析的基础上,固定离心转速为9000r/min,分别选取温度(θ/℃,A)、pH(B)、提取时间(t/min,C)作为海泥水溶体