纳豆提取物抑菌活性的研究

纳豆提取物抑菌活性的研究

纳豆是以大豆为原料，通过纳豆芽菌（bacema）发酵而成的传统日本大豆发酵食品。它也是一种生态健康食品，包含了100多种人体所需的生理活性物质，如纳豆激酶（nk）、维生素b2、二羟吡啶、溶菌酶、超氧化物歧化酶等。纳豆还有预防疾病和保健的功能。日本民间常以纳豆食、药两用,防治腹胀、腹泻、水土不服、肠道感染等疾病[1~5]。目前国内的研究主要针对纳豆激酶,对纳豆菌的液体培养条件及抑菌作用的研究也很多,但针对纳豆提取物抑菌作用的报道较少。本文以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌,采用滤纸片法确定纳豆提取物的抑菌特性,并对影响抑菌物质产生的条件及抑菌物质的理化性质进行了研究。1材料和方法1.1试验材料1.1.1保藏菌种chertchiacoli和企业间纳豆菌种,Natto1,2,3,4,BJC-2;指示菌为大肠杆菌(Escherichiacoli,下文用E表示)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,下文用S表示),本院微生物教研室保藏菌种。培养基为营养琼脂及牛肉膏蛋白胨液。市售粒大饱满的大豆,符合食品加工要求。1.1.2实验设备手提式高压灭菌锅,上海三申医疗器械设备有限公司;恒温培养箱(HWS-250),上海精宏实验设备有限公司;回转式恒温摇床培养箱(HZQ-Q),哈尔滨东联电子技术开发公司;中速离心机(16000r/min),湖南星科科学仪器有限公司;无菌操作台(HD-920型),哈尔滨东联电子技术开发公司等。1.2方法1.2.1种子菌悬液的制备纳豆杆菌菌种Natto1,2,3,4,BJC-2经营养琼脂斜面培养(37℃/24h)、活化,冷藏备用。挑取1~2环活化后的菌种,接入装有60mL牛肉膏蛋白胨液的三角瓶中,于37℃条件下震荡培养16~24h,摇床频率100r/min,装液量为60mL/200mL三角瓶,得种子菌悬液。测定纳豆菌培养液的吸光度(OD600)。当OD600≥1.6后放入冰箱,镜检无杂菌后冷藏备用。1.2.2纳豆芽孢杆菌的制备黄豆→挑选、去杂、浸泡→清洗→滤水→装三角瓶包扎(50g/200mL)→蒸熟(121℃/30min)→冷却接种(55℃)→发酵(37℃,24h)→冷藏(4℃,24h)→观察丝状物→取丝状物多者为本试验菌株。以5株纳豆芽孢杆菌为试验菌株,按照上述工艺制作纳豆,测试pH值,比较表面粘性物质的多少、拉丝情况及纳豆气味。以纳豆品质好、丝状物多者为出发菌株。1.2.3扩大培养模式用1.2.2节确定的纳豆菌,按1.2.1节方法进行扩大培养。从0h开始,每隔4h取样,共培养36h。以未接种培养液作为空白对照,利用比浊法(OD600)测其生物量,确定纳豆菌的最佳接种种龄。1.2.4纳豆提取液制备在经过后熟的纳豆中加入50mL无菌去离子水,100r/min浸提1h,得发酵液50mL,以16000r/min离心15min去菌体,得到100%纳豆提取液,冷藏备用。上述操作是在无菌条件下进行的。1.2.5牛肉膏蛋白液体培养基将指示菌接种到营养琼脂斜面上,37℃/24h培养后,接种牛肉膏蛋白胨液体培养基,振荡培养(100r/min,37℃,36h),镜检无杂菌,冷藏备用。1.2.6压力水固结剂的制备采用滤纸片法:用微量注射器分别吸取5、10、20、30、40μL100%纳豆提取液,一次性注射在一张滤纸片(Φ5±0.5mm)上,置于涂布了0.1mL(已稀释成10-1浓度)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的营养琼脂表面。滤纸片按照四点法放置,静止后倒置培养(37℃,36h),重复4次,测定抑菌圈直径的平均值。1.2.7纳豆发酵产生的抗菌物质条件试验1.2.7.抑菌圈直径测定大豆煮熟接种后,置于37℃温箱中发酵。从接种开始0h计,分别测试发酵8、16、24、32、40、48h的抑菌效果,按照1.2.4节方法制得提取物,测定其抑菌圈直径(平均值)。1.2.7.可溶性淀粉及甘油按照大豆质量的1%和2%添加葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉及甘油4种碳源,摇匀,蒸熟,冷却后接种发酵(37℃,24h)。按照1.2.4节方法制得提取物,测量抑菌圈直径(平均值)。1.2.7.抑菌圈直径测定在熟豆中分别加入已灭菌的质量分数为5%的硫酸铵、胰蛋白胨、牛肉膏、草酸铵和蛋白胨等氮源,接种发酵(37℃,24h),按照1.2.4节方法制得提取物,测其抑菌圈直径的平均值。1.2.8纳豆提取物中活性物质的稳定试验1.2.8.1.纳豆在不同成熟度下的抗菌效果纳豆发酵24h后,放入4℃冰箱中后熟,后熟时间分别为1、2、3、4、5、6、7d,取出,浸提离心后得提取液,用其做抑菌试验。1.2.8.保菌剂用量的确定将多份相同的纳豆提取液分别调制成pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,静置1h,放入无菌滤纸片浸泡20min,然后做抑菌试验,并以未调pH值的原抑菌提取液作为对照。1.2.8.抑菌活性试验将纳豆提取物分别置于60、80、100℃恒温水浴和121℃各处理20min,对照样置于室温,待冷却后,放入无菌滤纸片浸泡20min后做抑菌试验。2结果与分析2.1试验中选择的蘑菇由此可见,用BJC-2菌种制作的纳豆产生的黏液最多,黏性最强,且具有很浓的纳豆风味。因此选定纳豆BJC-2菌种为抑菌试验用菌株。2.2纳豆菌延滞期从图1可以看出,纳豆菌液体扩大培养时,0~8h为纳豆菌延滞期,8~24h为对数生长期,24~28h为稳定期,32h后为衰亡期。纳豆菌在24h时生长最好,因此确定24h为最适接种龄。2.3纳豆提取物对抗菌效果的精确试验和结果由表2可以看出,只需5μL纳豆提取物即有抑菌作用,随着其用量的加大,抑菌圈直径增大,抑菌效果明显。对金黄色葡萄球菌的抑制效果略好。2.4影响抗菌效果的因素2.4.1碳源物质对纳豆菌抗菌效果的影响在大豆中加入不同种类和浓度的碳源,结果如表3所示。从表3可以看出,加入不同碳源物质,对纳豆菌抗菌物质的产生及抑菌效果不同。添加一定浓度的碳源物质,抑菌效果均有提高,其中对金黄色葡萄球菌抑制效果明显。2.4.2外抑菌剂的添加量表4显示,加入一定比例的硫酸铵、胰蛋白胨、牛肉膏,对纳豆菌抑菌物质的产生有促进作用;而添加草酸铵和蛋白胨对抑菌物质的产生有一定的抑制作用,抑菌圈直径减小。但补充氮源抑制大肠杆菌的效果好于金黄色葡萄球菌的。2.4.3抑菌圈直径测定从表5可以看出,发酵8h时,开始产生抑菌物质。随着时间的延长,抑菌圈直径先增后减。抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌时,纳豆发酵时间分别为32h和24h的抑菌效果好。2.5抗菌物质的稳定性2.5.1成熟时间对抗菌效果的影响从表6可以看出,在纳豆保质期内,后熟时间对抑菌效果有一定的影响。后熟2d左右抑菌效果较好。2.5.2ph对抑菌活性的影响从表7可以看出,纳豆提取物经酸碱处理后pH值在7.0~9.0之间时抑菌活性几乎没有变化,pH5.0以下和pH9.0以上抑菌效果下降明显。表明纳豆菌产生的抗菌物质具有一定的酸碱稳定性,且中性环境下其抑菌活性好(对照组的pH值为中性)。2.5.3纳豆提取物的稳定性由表8可以看出,经过热处理和未经过热处理的纳豆发酵液,抑菌效果无明显变化,说明纳豆提取物中抗菌物质的热稳定性好。但在121℃湿热条件下放置20min,抑菌效果下降明显。3培养基对纳豆菌形成抗菌物质的作用纳豆菌在纳豆发酵中能够产生抑菌物质,并且具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,这与钟青萍等人对液体发酵过程中产生抗菌物质的研究结果一致