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拟南芥抗La突变体的筛选及鉴定的开题报告一、研究背景拟南芥（Arabidopsisthaliana）是一种常用的模式植物。已有许多的研究表明，拟南芥生长期间受到环境压力时，会产生各种各样的反应来应对环境的变化，如产生抗氧化物、活性氧清除剂等等，但这些反应机制涉及的分子机制很复杂。La蛋白是主要在植物胞质中广泛分布的一种RNA结合蛋白，它能与RNA二级结构的C端交叉文蛤，因此被认为是RNA-BindingProtein（RBP）。La蛋白和RNAs之间的结合和催化的RNA处理，可以通过消除RNA结构的动力学限制来促进RNA的物理加工。La蛋白被认为参与了微小RNA的生成、处理过程中的预-miRNA切割等。近年来，有研究发现La蛋白参与气体信使分子一氧化氮（NO）信号通路中，调节植物的生长发育和植物对逆境的响应等。由此，可以得出La蛋白在植物的重要作用，但目前对La蛋白参与NO信号通路的具体机制还不是很清晰。本研究旨在通过筛选和鉴定拟南芥中抗La基因突变体，进一步研究La蛋白与NO信号通路的关系及其作用机制。二、研究目的筛选La蛋白的受体蛋白，研究NO信号通路中La蛋白的作用机制，揭示其对植物生长、发育和逆境响应的影响。三、研究内容1.构建La蛋白突变体筛选载体；2.将拟南芥T-DNA插入突变库（SALK、GABI-Kat等）与构建的La蛋白突变体筛选载体进行基因组重组，筛选La突变体基因型；3.利用荧光蛋白标记La蛋白的互作受体蛋白进行鉴定；4.利用基因表达谱数据和生理生化检测手段，研究La突变体的NO信号通路响应和逆境响应特点。四、研究方案1.构建La蛋白突变体筛选载体采用PCR扩增技术，扩增La基因全长，并利用限制酶等手段将La基因克隆至真核表达载体pGEX-4T的多克隆位点GEX-6P3中。此外，在La基因的5'末端和3'末端后引入FRT（flippaserecognitiontarget）位点。在获得La突变体基因后，通过Cre/loxP方法实现对La基因的定向插入、打靶等。2.突变体基因组重组和La突变体筛选La突变体基因在T-DNA插入库中是随机插入的，La蛋白在突变突变体中发生突变的概率较低，因此利用PCR扩增该突变库的La基因序列，筛选La突变体基因型，并对其进行海因斯染色及测序，确认其是否属于La蛋白家族基因。3.利用荧光蛋白标记La蛋白的互作受体蛋白进行鉴定将La基因植入荧光蛋白标记载体中，通过转形子系统转化入烟草叶片进行La蛋白和互作受体蛋白的互作观测，确定各受体蛋白与La蛋白的互作作用。4.研究La突变体的NO信号通路响应和逆境响应特点通过高通量基因测序技术对La突变体和对照植物进行比对，寻找表达差异的基因，并对差异表达的基因进行GO、KEGG分析。同时，通过NO、氧气和甲醇等生物信号的处理等诱导方式，观察La突变体与野生型植株在生长发育和逆境响应等方面的差异。五、研究意义本研究将揭示La蛋白与NO信号通路的精细作用机制，进一步理解植物在生长发育和逆境响应上所起的重

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