凝胶渗透色谱

凝胶渗透色谱法测定分子量分布原理实验目的1掌握GPC测定物质分子量及其分布的根本原理和仪器的使用方法。2测定样品的GPC谱图，由软件获得Mn,Mw,PDI。色谱分类体积排斥色谱SEC(SizeExclusionChromatography〕的开展史1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小别离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象。1959年Porath和Flodin用葡聚糖胶联制成凝胶来别离水溶液中不同分子量的样品。1962年将高交联度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。凝胶色谱的任务

分子量的分布与高分子材料的所有关键加工特性以及材料性能紧密相关PlasticsTechnology,May1986聚合物的各种平均分子量

用SEC测得的不同种平均分子量可对应于其他仪器所测的值：Mn：用渗析计测出(Osmometry)Mw：用光散射计测出(LightScattering)Mv：用粘度计测出(Viscometry)Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge)Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity)

Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1分子量分布增加分子量PD=Mw/Mn

增加浓度聚合物的分子结构单分散性聚合物窄分布聚合物中等分布聚合物宽分布聚合物Mw/Mn=1.00Mw/Mn<1.20Mw/Mn<2.00Mw/Mn>2.00分子量分布体积排斥色谱〔SEC)工作原理以多孔树脂为固定相，用溶剂推动分子量大小不同的样品流过固定相产生大小分子顺序流出的别离流出级份的保存时间〔洗脱体积〕提供其分子量〔尺寸〕的信息用检测器得到各流出组分的强度和流出时间用分子量的标样标定出流出时间和分子量的关系用标定好的时间和分子量的关系对未知样各流出级份的时间〔分子量〕和强度进行统计计算得到分子量分布色谱仪组成示意图InOutSR缓冲柱色谱柱溶剂输送系统在线脱气放空阀废液管示差折光检测器恒温区废液溶剂进样阀柱温箱预热板自动进样器凝胶渗透色谱HLC-8320GPC生产厂商：日本东曹株式会社HLC-8320GPC操作规程1翻开电脑，点击EcoSEC-WS工作站，输入密码，进入采集控制应用程序。2开启仪器电源，点击工作站控制系统Power按钮，待联机显示成功后，设定流速、温箱温度和检测条件。3设定WarmUp时的流速和待机时间，并执行该程序。4将待测样品放入样品托盘，设定运行时间、数据采集时间、样品测定序列，执行Analysis程序，进行标准物质和样品的测定及数据处理。5测试完毕后，执行ShutDown程序，待控制面板显示PowerOff后关闭仪器电源和电脑。凝胶渗透色谱(GPC:Gelpermeationchromatography)主要用于聚合物领域以有机溶剂为流动相(氯仿，THF，DMF)常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物凝胶过滤色谱(GFC:Gelfiltrationchromatography)主要用于生命科学领域以水溶液为流动相常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺等)SEC分类GPC载体的种类：1.交联聚苯乙烯凝胶2.多孔性玻璃3.半硬质及软质填料包括聚乙酸乙烯酯凝胶及聚丙烯酰胺凝胶4.木质素凝胶等DVB/PSPackingParticle20,000x有机GPC介质悬浮聚合产生苯乙烯基二乙基苯聚合物的单体颗粒开始的小颗粒融合集合成最终的颗粒仔细控制反响环境产生出适宜的单体孔和颗粒的尺寸PoreStructureDefinesResolvingRange体积排除别离机理GPC是如何工作的SEC体积排除色谱〔GPC〕不同于HPLC,没有化学作用。SEC体积排除色谱〔GPC〕依靠单纯的物理别离原理。

时间顺序(A)样品进入(B)尺寸分离(C)大尺寸溶质洗提(D)小尺寸溶质洗提溶剂流动混合样品多孔性填料色谱图（浓度淋洗曲线）(A)(B)(C)(D)进样保留时间示差检测器凝胶色谱柱的别离参数色谱柱体积++++++填料颗粒尺寸0++++填料颗粒的孔隙率+0+填料颗粒的形状000孔的尺寸分布+0+孔的形状0000=可以忽略的因素+=影响适中的因素++=影响很大的因素

凝胶柱的别离按照尺寸进行峰的别离峰加宽分辨率和准确率色谱柱填料:色谱柱对GPC/SEC

色谱别离的影响分子量MW

vs.淋洗体积淋洗体积(mL)Log(分子量MW)

10.0

15.0

20.0

25.0

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00全部渗入排斥极限GPC/SEC体积排斥色谱排阻极限 ----不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效别离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到别离。随固定相不同，排阻极限范围约在400至60×106之间。渗透极限 ----能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。在选择固定相时，应使欲别离样品粒子的相对分子质量落在固定相的渗透极限和排阻极限之间。为GPC加热的理由使GPC检测处在一个温度稳定的环境降低流动相黏度，使得谱柱内部溶剂处于接近理想的GPC状态〔如Polyethylene–Terphthalatem-Cresol+0.05mLiBr/100°C〕尽量减轻分子间的弱相互作用〔样品分子间、样品和溶剂分子间、填料和样品分子间等〕使难于溶解的样品得以溶解〔如聚烯烃PE\PP、工程塑料PPS等〕溶剂特性溶剂（中文）溶剂（英文）极性黏度（cP）沸点（℃）己烷Hexane7.30.3386环己胺Cyclohexane8.2181甲苯Toluene8.90.59110乙酸乙酯Ethylacetate9.10.4577四氢呋喃Eetrahydrofuran9.10.5566氯仿Chloroform9.30.5761甲乙酮Methylethylketone9.30.480二氯甲烷Dichloromethane9.70.3940二氯乙烷Dichloroethane9.80.7983丙酮Acetone9.90.3256二氯苯Dichlorobenzene101.26180三氯苯Trichlorobenzene101.89213间甲苯酚m-Cresol10.216.9202临氯酚o-Chlorophenol10.24.11175二甲基乙酰胺Dimethylacetamide10.80.77166氮甲基吡咯烷酮n-Methylpyrrolidone11.31.65202二甲基亚砜Dimethylsulphoxide121.1189二甲基甲酰胺Dimethylformamide12.10.9153六氟乙丙醇Hexafluroisopropanol12.21.0258PolyisobutylenePolybutyleneChlorinatedRubberPolybutadienePolyisoprenePolydimethylsiloxaneChlorinatedPolyethylenePolyethylene–EthylacrylatePolyethylene–VinylacetonePolyethylene–MethacrylicacidPolyphenyleneoxidePoly-4-methylpentene(1)PolyethyleneUltra-highMolecularWeightPolyethylenePolypropylenePolyetheretherketonePolyetherketoneTolueneToluene/75%TCB/135-160°CTCB/135-160°CPhenol/TCB1:1/145°C各种样品所对应的溶剂条件各种样品所对应的溶剂条件Melamine–FormaldehydeNylon(Alltypes)Polybutylene–Terphthalate(PBT)Polyethylene–Terphthalate(PET)PolyAcrylonitrile(聚丙烯睛)ABS(Acrylonitrile–Butadiene–Styrene)ASA(Acrylic–Styrene–AcrylonitrileABA(Acrylonitrile–Butdiene–Acrylate)CarboxymethylCelluloseABS/PolycarbonatePolybutadiene–AcrylonitrilePolyurethanePolyacetalPolyoxymethylenePolyimidePolyamide–imidePolyetherimidePolyethersulfonePolyvinyldienefluoridePolyfuran–FormaldehydeHexafluoroisopropanol+0.075MSodiumTrifluoroacetate/55°Corm-Cresol+0.05mLiBr/100°CDMF+0.05mLiBr/85°CDMF+0.05mLiBr/145°CN-MethylPyrrolidone+0.05mLiBr/100°CDimethylacetamide/60°CPolycarbonatePolyglycolicacidAcrylonitrile–MethylmethacrylateCelluloseAcetateCelluloseAcetate–ButyrateCelluloseAcetate–ProprionateCelluloseNitrateCelluloseProprionateCelluloseTriacetateDiallylPhthalateEthylCelluloseEpoxyPolyesterAlkydPolybutene(1)Polybutadiene–StyrenePhenol–FormaldehydePhenol–FurfuralPolymethylmethacrylatePolypropyleneglycolPolystyrenePolysulfonePolyvinylacetatePolyvinylbutyralPolyvinylchloridePolyvinylchloride–AcetatePolyvinyldienechloridePolyvinylformalPolystyreneAcrylonitrilePolystyrene–AlphamethylstyrenePolyesterThermosetPhenolicsRosinAcidsPolyglycolicAcidMethylChloridegamma-ButylLactoneTHF/40°C参数溶质构造+++++溶剂流速0++++溶剂粘度0++温度0++0=可以忽略的因素+=影响适中的因素++=影响很大的因素峰的别离峰加宽分辨率和准确率影响GPC/SEC色谱别离

操作参数的因素摘要4凝胶渗透色谱的特点实验所需时间可以预知整个洗脱过程用恒定比例的淋洗液，不能用梯度洗脱一般情况下试样能溶解就能测定，减少了用于摸索实验条件所需的时间组分的保存时间提供其分子尺寸的信息以时间顺序流出的级份进行分级收集就得到了目标分子量的样品可以进一步分析〔GPCcleanup〕Temp.(DegC)18.519.019.520.0MV-1.000.001.002.00Minutes51015202530354045505560657075实验室温度波动对RI检测器基线的影响MobilPhase–Methanol@0.25/mLminuteDetectorTemp35CNoColumnHeaterUsedRoomTemperatureRIBaseline别离式系统温度稳定性的解决方案

与色谱追求的别离度相矛盾〔柱外扩散〕多检测器集成的GPC系统紫外检测器〔浓度型〕粘度检测器〔分子量型〕多角激光光散射检测器〔分子量型〕红外接口〔特征基团型为测量短链支化〕影响凝胶渗透色谱数据的因素输液系统样品制备进样系统柱温变化色谱柱性能检测器流动相标样类型的选择和分子量范围的选定溶剂输送系统高流速精度是获得重现性GPC结果的根底微小的流速误差会导致分子量计算的很大误差使用参考峰(FlowMarkers)的技术可校正流速误差固态(半结晶)液态(稀溶液)样品制备的影响溶剂必须聚合物链翻开成最放松的状态允许充分的时间让链展开有些聚合物需要大于3小时分子量及结晶度愈大，所需真正溶解的时间就越多某些结晶的聚合物需要加热除非该样品可能会有剪切效应发生，聚合物溶液必须过滤为了增加样品的溶解，可轻微扰动〔不要剧烈摇动或用超声〕窄分布标样不必过滤，高分子量标样也不要剧烈摇动可使用在线过滤器，但是不推荐使用保护柱由于凝胶色谱中浓度检测通常使用示差折光检测器，其灵敏度不太高，所以试样的浓度不能配置得太稀。但另一方面色谱柱的负荷量是有限的，浓度太大易发生“超载〞现象。一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在0.05～0.5%〔质量分数〕范围内配置。分子质量越大，溶液浓度越低。标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超声或者剧烈振荡来加速溶解。溶液进样前应先经过过滤，以防止固体颗粒进入色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。40瓶位样品盘2ml玻璃瓶卷边压紧铝瓶盖优先进样的样品缓慢搅拌双温区设计是降解风险降至最低

进样点热区温区50100200温度(C)-20-1001020瓶位CarouselMotion进样点Agitated自动进样器在柱温箱中平衡的进样瓶可编程ExcesssolutionreturnedtovialInjectionprecisionRSD<1%withnocrosscontaminationNewMultipleInjectioncapabilityupto3injectionspervial……..柱温箱进样阀

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色谱柱对数据的影响

GPC色谱柱选择按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列----溶剂一般为THF、氯仿、DMF等，必须选择适宜的溶剂来溶解聚合物。按照样品分子量范围来选择柱子型号----样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并且最好是处在校正曲线线性范围内柱效率N和别离度R----色谱柱的效率可借用“理论塔板数〞N进行描述。两个样品到达完全别离，R应等于或大于1，如果R小于1，那么别离是不完全的。聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚环氧乙烷(PEO，也叫聚氧化乙烯，溶于水)聚乙二醇(PEG，溶于水) (PEO与PEG的碳链骨架相同，但是其合成原料和封端不同，由于原料的性质，使其产物的分子量和结构都有一定的区别。PEO常是指一端为甲基封端，一端为羟基封端的聚环氧乙烷，而PEG一般是两端都是羟基封端的聚乙二醇。)

标样样品分子量应该处在标样分子量范围以内。分子量校准曲线凝胶渗透色谱的开展多检测器的应用快速GPC技术微流量GPC技术新型色谱柱技术多检测器的比较配置方法分子量支化回转半径传统GPC相对于标样的色谱柱校正，得到相对分子量不能不能使用普适校正的传统GPC需从文献上得到准确的K/a值，对相对分子量进行的色谱柱普适校正得到绝对分子量不能不能配了黏度检测器的GPC测出特性黏数，得到K/a值的普适校正能，直接从特性黏数测出能，但是间接得到配了多角激光检测器的GPC绝对测出，无需色谱柱校正能，但要符合一些假设能，当有两个测量角以上三检测器联用的GPC准确结果能能用多检测器GPC技术探究poly(n-butylmethacrylate)的支化结构

TheMWDsindicatethesamplestobeextremelyheterogeneousandgavemulti-modaldistributions.

TheMark-Houwinkplotsshowthatalthoughtwoofthesamples(greytraces)weresimilarinstructure,thethird(blacktrace)gavelowervaluesofintrinsicviscosityatanygivenmolecularweight,indicativeofthemoredensepolymerstructurewhichaccompaniesanincreaseinthelevelofpolymerbranching.聚合物色谱中的检测器浓度响应值正比于浓度C实例：示差(refractometer)检测器

N=(dn/dc)C紫外检测器蒸发光散射检测器使用单一浓度型检测器的体积排除别离模式色谱被称作传统GPC浓度示差，紫外，蒸发光散射(ELSD)，…分子量敏感

粘度，光散射组成

多波长紫外，示差+紫外，质谱(MS)，付里叶变换红外(FTIR)，…

“绝对〞分子量分布的测定RI/V检测器结合使用VI的响应值正比于C

H/M=C[]H，大分子的尺寸；流体力学体积[]=VI/RI，特征粘度(intrinsicviscosity)

普适校正的假设：具有同样大小(H)的大分子应有同样的洗脱体积，即依赖性在给定的流动相、色谱柱组及温度下，H=H(V)是通用的LogH246810ElutionvolumeV,mL16182022242628RI/V检测器结合使用，第一步：用任何窄分布标样(化学结构不重要)建立普适校正曲线[]

ST=VI/RI foreachstandardH=MST

[]ST foreachstandardPolynomialfittoLogHuniversalcalibrationcurve“绝对〞分子量分布的测定RI/V检测器结合使用第二步：用聚合物分布每一切片“i〞计算“绝对〞分子量[]i=VIi/RiiMi=Hi/[]i1683Run11683Run21683Run31683Run41683Run51683Run11683Run21683Run31683Run41683Ru