川楝子中黄酮类化合物的提取

川楝子中黄酮类化合物的提取

黄酮类化合物是一种多酚类化合物，广泛分布于自然界，许多植物可以合成。大量研究表明,黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调节免疫、防治血管硬化和降血糖等功能。川楝子,别名金铃子,为楝科植物川楝(MeliatoosendanSie.EtZucc.)的果实,为较常用的中药。川楝子中含总黄酮约为3%,具有较高的利用价值。川楝黄酮对羟基自由基和超氧阴离子自由基有很好的清除作用,当黄酮质量浓度达到12.38g/L时,对羟基自由基的清除效率达到84%;当黄酮质量浓度达到9.74g/L时,对超氧阴离子自由基的清除效率达到76.6%。由此可以看出对川楝黄酮研究的重要性。作者主要研究了以50%乙醇为溶剂,采用超声波法提取川楝子中的黄酮类化合物,提取物经有机溶剂萃取分离和聚酰胺柱层析纯化后,将所得到的黄酮类化合物通过薄层层析、颜色反应和高效液相色谱分析进行结构研究。1材料和方法1.1原材料川楝子,2008年9月采摘于四川省宜宾市林业局。1.2超声波提取法川楝子洗净、去核、粉碎后准确称取一定量于烧杯中,加入50%的乙醇溶液,料液比1∶40(g∶mL,下同),在80℃下超声波提取40min,得到提取液,总黄酮得率为0.561%。1.3化合物的分离和表征提取液经减压蒸馏浓缩成浸膏,加入热水将浸膏溶解后,依次用石油醚萃取5次、乙酸乙酯萃取4次、正丁醇萃取4次,分别浓缩各萃取液至浸膏状并回收萃取剂,取正丁醇萃取液浸膏进行聚酰胺柱层析,得到化合物供结构鉴定。1.4氯化铝-甲醇溶液显色剂试验对实验各阶段所得液体采用硅胶G板进行薄层层析分析,以正丁醇-冰醋酸-水体积比4∶1∶5为展开剂,芦丁-甲醇溶液为对照品。展开后,用2%的三氯化铝-甲醇溶液作显色剂,将板置于紫外灯下观察,记录并计算Rf值。根据层析结果初步判断液体中所含成分、纯度及其结构。1.5显色试剂的选择取样品溶液与HCl-Mg、HCl-Zn、10%NaOH、浓H2SO4、AlCl3-CH3CH2OH等5种显色试剂进行颜色反应,反应后在可见光下观察其颜色变化,初步判断其黄酮类化合物所属类型。1.6色谱检测条件在正丁醇萃取浸膏中加入80%的甲醇溶液,配制成质量浓度为31g/L的溶液,加入1/4甲醇量(体积)的浓度为4mol/L的HCl溶液,搅拌均匀,置于水浴锅中78℃恒温2h。水解完毕后将水解液置于离心机中以3000r/min离心5min,取上层清液1mL用80%甲醇溶液稀释至15mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,滤液待检测。色谱柱为SunfireC18柱(4.6mm×250mm);柱填料5μm;柱温为室温;检测器为紫外检测器;检测波长365nm;流动相为70%甲醇;pH值3;流速0.8mL/min。2结果与讨论2.1标准品芦丁的rf川楝子的乙醇提取液经石油醚萃取后按1.4节操作,在可见光和紫外光下均无斑点,这说明川楝子的乙醇提取液经过石油醚萃取后,其萃取液中不含有黄酮类化合物。石油醚萃余液经过乙酸乙酯萃取后,萃取液经薄层层析后喷入显色剂,得到3个在254nm紫外光下显黄色的斑点,Rf1=0.69、Rf2=0.795、Rf3=0.892,标准品芦丁的Rf=0.68。说明石油醚萃余液经乙酸乙酯萃取后,萃取液中含有3个黄酮类化合物。乙酸乙酯萃余液经过正丁醇萃取后,萃取液经薄层层析后喷入显色剂,得到2个在254nm紫外光下显黄色的斑点,其Rf1=0.612、Rf2=0.682,说明乙酸乙酯萃余液经正丁醇萃取后,其萃取液中含有2个黄酮类化合物。正丁醇萃余液经薄层层析后喷入显色剂,得到一个在254nm紫外光下显黄色的斑点,Rf1=0.69,说明正丁醇萃余液中含有1个黄酮类化合物。2.2洗脱溶剂成分以蒸馏水、10%、30%、50%、75%、95%、100%(体积分数,下同)梯度乙醇为洗脱剂,采用聚酰胺柱层析纯化正丁醇萃取物,收集各乙醇洗脱液,共26个流分,其中蒸馏水洗脱剂收集2个流分,其余洗脱剂均收集4个流分。取各流分进行薄层层析分析。结果表明:50%乙醇洗脱液的第2、第3流分为相同流分,合并,其经过减压蒸馏浓缩、低温处理后析出粉末状晶体,反复结晶后为流分Ⅰ,其在254nm紫外光下显黄色的斑点,Rf=0.612;75%乙醇洗脱液的第4流分和95%乙醇洗脱液的第1流分为相同流分,合并,经过减压蒸馏浓缩、低温处理后析出粉末状晶体,反复结晶后为流分Ⅱ,其在254nm紫外光下显黄色的斑点,Rf=0.682。柱层析结果表明:川楝子提取物的正丁醇萃取液经过柱层析后分离纯化,经薄层层析进行检识,合并相同流分后得到流分Ⅰ、Ⅱ,并初步判定其中含有2种黄酮类化合物。2.3色试剂的选择将经过柱层析分离纯化的流分Ⅰ、Ⅱ取出,溶解于无水乙醇中分别与以下5种颜色反应试剂进行颜色反应,其结果如下。从颜色反应可以初步判断,川楝子提取液经过有机溶剂萃取后,在正丁醇萃取液中含有黄酮类或黄酮醇类化合物。2.4水解流分测定实验中提取的黄酮类化合物流分Ⅰ、Ⅱ多为黄酮苷,经水解为苷元和糖配基,以标准品芦丁、槲皮素、桑色素为对照,用高效液相色谱法测定水解后的流分。图1(a)是流分Ⅰ的HPLC谱图,与标准样品谱图对照发现,6.403和11.220min处的信号峰分别源自于芦丁和桑色素。图1(b)为流分Ⅱ的HPLC谱图,芦丁的信号峰出现在6.293min。3化合物结构分析3.1通过薄层层析分析表明川楝子提取液经连续萃取后,石油醚萃取液中不含黄酮类化合物,乙酸乙酯萃取液中含有3个黄酮类化合物,正丁醇萃取液中含有2个黄酮类化合物,萃余液中含有1个黄酮类化合物。3.2正丁醇萃取液经过柱