复发性单纯疱疹性角膜基质炎的动物模型的建立

复发性单纯疱疹性角膜基质炎的动物模型的建立

单带流行性疾病（i型h-vius，1）是由感染膜感染的单次性膜生动物（hsk）引起的单次性膜生动物化学克林氏感染的疾病。这是由cd4和t细胞诱导的免疫炎。为了进一步研究CD4+T细胞的两种亚型——Th1细胞和Th2细胞在HSK免疫病理过程中所起的作用,我们制备了复发性HSK的BALB/c鼠的模型,用逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)检测Th1细胞和Th2细胞分泌的细胞因子在鼠的角膜组织中的表达水平,并探讨细胞因子的表达与复发性HSK之间的关系。材料和方法一、动物模型的制备1.空斑单位的使用病毒为隔离的人的高神经毒力的单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpessimplexvirustype1,HSV-1)Mckrae毒株(美国华盛顿大学眼科中心提供),使用前滴度为2.2×1012空斑单位(plagueformingunit,PFU)/L。生产和检测病毒的细胞为非洲绿猴肾细胞(Africangreenmonkeykidney,VERO)。培养VERO细胞的营养液为含5%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)、链霉素(0.1g/L)改进的最小基础培养基(dulbecco′smodifiedeaglemedium,DMEM,美国Gibco公司提供)。2.病毒在右眼角膜上的感染途径(1)动物:选用鼠龄4～6周、体重18～21g的雌性BALB/c小鼠(中国医科大学附属第二医院动物实验室提供)180只作为实验对象,采用随机数表方法将其分为两组,每组90只。实验组:角膜接种HSV-1。对照组:角膜不接种病毒。(2)方法:实验组鼠麻醉后置于显微镜下,用无菌手术尖刀片交叉划伤右眼角膜上皮层呈“#”字形;将5μl含有1×106PFU病毒的DMEM滴于右眼角膜表面,轻轻按摩鼠的眼睑;同时向鼠的腹腔内注射人的抗病毒血清1ml(美国Chemicon公司产品,该血清中和HSV-1的半数有效剂量为1/640),使病毒潜伏于三叉神经节内而角膜恢复光滑透明,限制病毒扩散使鼠100%存活。对照组鼠的右眼角膜划伤后滴5μl不含病毒的DMEM。3d后,用蘸有DMEM的湿棉签擦拭右眼角膜表面的泪液膜并将其放入装有1mlDMEM的试管中,用VERO细胞培养的方法检测擦拭液中有无病毒存在;并于接种后第3天和1周时,在裂隙灯显微镜下检查角膜情况。除外无树枝状、地图状角膜炎或泪液膜中未检测出病毒的鼠,余鼠继续养育6周,使急性上皮性角膜炎愈合并使病毒在三叉神经节内建立起潜伏感染。在此期间,每周用裂隙灯显微镜检查角膜1次,观察病毒有无自发性复发。7周时,采用随机数表方法抽取实验组10只小鼠,取接种侧角膜表面泪液膜及三叉神经节检测病毒,证实潜伏感染已建立。3.b.细胞菌群7周时,将处于病毒潜伏期且角膜恢复光滑透明的70只实验组小鼠和70只对照组小鼠麻醉后,用紫外线B光照射鼠的右眼角膜,激活潜伏感染的病毒。紫外线B光光源为TW20Chromato-Vutransilluminator(美国UVP公司产品),其光波波长为302nm,每只鼠的右眼接受170mJ/cm2紫外线。于紫外线照射角膜的当天及照射后的7d内,每天1次用蘸有DMEM的湿棉签擦拭右角膜表面泪液膜,并将擦拭液用VERO细胞培养,检测单纯疱疹病毒,判定病毒是否复发。4.视网膜及新生血管接射线特征紫外线照射角膜后的第1～10、14、21及28天,每天1次用裂隙灯显微镜检查角膜改变。(1)评估角膜基质炎的标准(0～4分):0分,角膜基质清晰透明;1分,角膜基质稍混浊;2分,角膜基质中度混浊,可透见后部虹膜特征;3分,角膜基质重度混浊,但仍可判断瞳孔缘的位置;4分,角膜基质完全混浊,失去后部特征。(2)评估角膜新生血管化的标准(0～2分):0分,无新生血管长入角膜;1分,新生血管向心性生长,但未达到瞳孔中央或未超过角膜半径;2分,新生血管达到瞳孔中央或超过角膜半径。5.hsk复发性疾病的组织病理学检查紫外线照射角膜后的第28天,取鼠右眼球,用10%甲醛固定,石蜡包埋,常规苏木素-伊红(HE)染色。二、半定量rt-pcr方法用于检测遗传因子的表达1.大鼠视网膜下环参数法分别于紫外线照射前(0d),照射后第3、7、10、14、21及28天,在无菌条件下用环钻微型切割器于角膜中央切取直径2mm的角膜环,每个时间点取6只实验组鼠的角膜和6只对照组鼠的角膜,放入无菌试管中,于-70℃冰箱内保存。2.总rna提取取角膜标本放入试管中置于冰上,剪碎、研磨,加1mlRNA提取液(TRIzol-Reagent,大连宝生物工程有限公司提供),用5ml注射器抽吸10次成乳状。用氯仿、异丙醇、酒精等处理提取总RNA。所得样品RNA于-70℃冰箱内保存。紫外分光光度仪测吸光度A260/A280值,利用A260计算RNA浓度,并稀释至1g/L。3.逆转录合成第一链互补dna应用KATARABiotechnolgy试剂盒(大连宝生物工程有限公司)做cDNA合成。4.pcr扩增系统PCR反应体系25μl,包含模板(第1链cDNA)3μl,2.5mmol/LdNTP2μl,5U/μlTaqDNA聚合酶0.2μl,10×PCR反应缓冲液2.5μl,β-actin上、下游引物各0.5μl,IFN-γ或IL-4或IL-6或IL-10或IL-12上、下游引物各0.6μl,双蒸水15.1μl,在美国产PTC-100TM型PCR扩增仪上扩增35个循环,94℃预变性3min;94℃变性45s,59.5℃退火60s(IFN-γ:59.5℃;IL-4:53.5℃;IL-10:54.5℃;IL-12p40:53℃),72℃延伸90s,最后1次反应72℃延伸7min。引物(由北京奥科生物技术有限责任公司合成)的核苷酸序列和扩增产物大小见表1。5.细胞因子mrna表达量的测定取扩增产物5μl,在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,溴化乙锭染色,紫外线灯下观察电泳带并拍照,经Kodak-1D型凝胶成像系统(美国EastmanKodak公司)输入计算机,用MolecularAnalyst(version1.4.1)软件对泳带进行吸光度(A)值测定,所得数值代表细胞因子mRNA及β-actinmRNA的绝对表达量,以二者的比值(N值)代表细胞因子mRNA的相对表达量。三、不同处理条件对鼠视网膜细胞因子的影响各种细胞因子mRNA的数据均以均值±标准差表示。实验组小鼠受紫外线照射后不同时间点角膜表达的细胞因子水平与照射前比较采用t检验;实验组与对照组小鼠受紫外线照射后不同时间点角膜表达细胞因子水平的比较也采用t检验进行统计学分析。结果一、复发性视网膜感染的临床表现BALB/c鼠的角膜接种HSV-1后第3天的角膜表面泪液膜中检测出HSV-1复制,所有鼠均患急性上皮性角膜炎。角膜接种HSV-1后第7周时,抽样10只小鼠检测HSV-1结果为角膜表面泪液膜内阴性,而三叉神经节内阳性,证实小鼠处于病毒潜伏感染状态。处于病毒潜伏感染期的鼠和对照组的鼠接受了相同剂量的紫外线照射后,对照组鼠仅表现为轻微的角膜水肿及一过性角膜新生血管化,很快恢复正常,泪液膜内未检测到病毒。实验组78.6%(55/70)鼠的泪液膜内检测到病毒复制,即病毒的复发率为78.6%;复发性角膜感染主要表现为角膜基质炎,裂隙灯显微镜下可见角膜基质混浊及角膜新生血管化。组织学检查可见角膜上皮层完整,基质内有大量的炎性细胞浸润,主要为淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞,有的前房内可见大量炎性细胞渗出。紫外线照射后不同时间的平均角膜混浊程度(图1)和平均角膜新生血管化程度(图2)显示:角膜基质混浊于紫外线照射后第3天开始出现,7～14d为角膜基质混浊的高峰时间,14d后角膜基质混浊逐渐下降,处于恢复期;角膜新生血管化于紫外线照射后第3天开始出现,并且迅速加重,第7～28天为角膜新生血管化严重的时间。二、mrna的表达处于病毒潜伏感染期的小鼠(实验组)和未感染病毒的小鼠(对照组)接受相同剂量的紫外线照射后,细胞因子在角膜组织的表达结果见图3。潜伏感染期的小鼠(条带8～14)经紫外线照射后,IFN-γ、IL-12、IL-10和IL-4mRNA在角膜组织中均有表达。其中,IFN-γmRNA在临床疾病出现前和疾病发展过程中(病毒激活后3～14d)高表达,在疾病恢复期(14d后)表达减弱;IL-10mRNA在病毒激活后的第3天开始表达于角膜组织,表达的高峰时间为第7～14天,14d后表达逐渐减弱,以稍低的表达水平平行于IFN-γ的表达;IL-4mRNA在病毒激活后的第3～14天有明显表达,14d后表达迅速下降,几乎接近于病毒激活前的水平;IL-12mRNA是角膜组织内表达最丰富的细胞因子,在病毒激活后的第3天即开始高表达,高表达持续经过整个观察期,其表达趋势平行于临床观察到的角膜新生血管化曲线(表2)。对照组小鼠角膜(条带1～7)经紫外线照射后,IFN-γ和IL-4mRNA无表达;IL-12mRNA有明显的表达(第3～14天),但表达水平明显低于实验组(P<0.01);IL-10mRNA有微弱表达(第7～10天),表达水平明显低于实验组(P<0.01,表3)。讨论一、hsv-1和hsk感染的检测制备复发性HSK的实验模型,首先要建立起HSV-1潜伏感染的模型,然后用特定的条件或因素来诱导复发。我们选用BALB/c鼠,经角膜接种HSV-1后,HSV-1在三叉神经节内成功地建立起潜伏感染,潜伏感染阶段为原发感染后的2～6周。病毒接种后第7周时,随机抽样10只小鼠,检测HSV-1结果为角膜表面泪液膜内阴性,而三叉神经节内阳性,证实小鼠处于病毒潜伏感染状态。用紫外线B光照射鼠的角膜诱导HSK复发。本研究结果显示:HSK的复发率为78.6%;复发性HSK主要表现为角膜基质混浊,基质层内有大量的炎性细胞浸润,角膜新生血管化,与人类复发性单纯疱疹性角膜炎的表现非常相似。二、hsk初感染模型的建立单纯疱疹性角膜基质炎是一种由CD4+T细胞介导的免疫病理性疾病。为了进一步探讨CD4+T细胞的两种亚型——Th1细胞和Th2细胞在HSK发病过程中所起的作用,研究者经常采用两种方法进行研究:一是检测感染的角膜组织上表达的细胞因子;二是观察外源性细胞因子及细胞因子抗体的使用对HSK疾病程度的影响。既往学者采用鼠的原发性感染模型进行研究,发现细胞因子的类型随着疾病的进展发生着相应的改变。例如Th1型细胞因子(IFN-γ和IL-2)在疾病的早期表达,与HSK恶化的炎性反应有关,Th2型细胞因子(IL-10和IL-4)在疾病的晚期表达,与损伤的修复及保护性抗体反应有关。然而最近的研究却显示IL-2和IL-12对HSK具有高度保护作用,与既往研究的结果相矛盾,并且这些由原发性感染模型得到的结果无法直接推测到人类复发性病毒性角膜炎中来。因此,本研究采用复发性感染模型,检测在HSK复发过程中角膜组织表达的细胞因子类型,探讨细胞因子的表达与疾病程度之间的关系,为HSK的免疫学治疗提供理论依据。本研究结果显示:在HSK复发的早期,Th1型细胞因子(IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-10、IL-4)同时表达于角膜组织中。其中,IFN-γ和IL-10在角膜基质混浊的发生、发展过程中呈高表达,在角膜基质混浊减轻即疾病恢复过程中呈低表达,即IFN-γ和IL-10的表达水平与HSK的疾病程度密切相关,提示Th1型细胞因子反应和Th2型细胞因子反应可能均有助于小鼠抵御单纯疱疹病毒的复发感染。此结论与Cantin等的研究结果一致。Cantin等采用IFN-γ基因敲除鼠和IFN-γ受体基因敲除鼠,建立潜伏感染模型,然后用高热诱导病毒激活,发现尽管IFN-γ不涉及病毒激活的诱导,但是病毒一旦被激活,IFN-γ能迅速增加、抑制病毒的复制。在以往的研究中,我们将外源性重组IL-10注射到小鼠角膜组织中,发现IL-10能有效地抑制复发性HSK的发展。IL-12是单核细胞、B细胞、多形核白细胞的产物,能诱导Th1型细胞反应。本研究结果显示:IL-12在紫外线照射潜伏感染期小鼠角膜后的第3天即迅速增加,并且保持高表达经过整个观察期。尽管对照组鼠于紫外线照射后的第3～14天角膜组织也表达IL-12,但与实验组比较表达量相对较低且表达时间短。因此,我们认为虽然紫外线照射也能诱导正常角膜组织表达某些细胞因子,但是IL-12在复发性HSK鼠的角膜组织中高表达与HSK的复发密切相关。至于IL-12在HSK复发过程中的作用,尚待进一步探讨。三、hsk细胞因子与th1和th2细胞增殖相关实验初发性基因子的关系IL-4和IL-10为Th2型细胞因子。在小鼠原发性感染模型中,IL-4和IL-10在疾病的后期(急性感染后第21天)才有表达,因此,被认为与疾病的修复和控制炎性反应有关。本研究中,IL-4和IL-10在疾病早期(病毒被激活后的第3天)就有表达,考虑与T细胞的免疫记忆性有关。在HSV-1原发感染阶段,幼稚性T细胞受病毒抗原刺激后分化、增殖为效应性CD+4Th1细胞和Th2细胞;这些细胞在