绿色荧光蛋白基因在植物病害研究中的应用

绿色荧光蛋白基因在植物病害研究中的应用

0gfp基因的特性根据zhalgiu的研究，1994年，gfp首次将其基因移植到杆菌和线虫中，至今已超过一半。GFP基因作为一种全新的非酶报告基因,因不具有种属特异性;可与不同颜色的标记分子结合,利于进行双色检测;基因片段小,可与多种不同蛋白质的N端或C端相融合,而不会改变天然蛋白质的原有特性;表达产物可耐高温(65℃),具有宽的PH范围(6~12),能抵抗多种变性剂和蛋白酶的作用;所产生的绿色荧光持续时间长,且不需要任何辅助因子的作用等特性,而在各研究领域中受到更多青睐,并已经在细菌、蓝细菌、酵母、哺乳动物和植物中得到广泛应用。在此,笔者仅就国内外利用GFP基因在植物病害研究中的应用及应用中存在的问题作简要综述,以期对相关研究有所启示。1gfp突变基因野生型GFP基因在最初植物病害研究中表明,在大多数植物细胞中GFP基因表达不强,造成标记植株与原植株难以区别,失去标记的意义。在对GFP进一步的研究中发现,GFP的荧光特性(激发与发射光波长和荧光强度)可随其分子内某些位置,特别是生色团及其附近氨基酸的突变而改变。在此发现的基础上,Crameri,Cormack,Heim等[3~5]分别构建出具有强表达和荧光的GFP突变基因,Eberl并利用GFP突变基因标记恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida),发现该基因产生的绿色荧光与野生型的相比具有更强的荧光,且在细胞质中的分布更均匀、可溶性也更好。大量对GFP基因的有效改造使得该基因在植物病害研究中得以被广泛应用。1.1gfp基因的应用在植物病害防治中,最好的方法是利用抗性植株与有益生防生物的共同作用。两者的结合既可使抗性植株的抗性得到诱导又能克服生防的短期作用。因此,对于抗性植株的构建筛选成为目前遗传育种研究的热点。过去,转基因植株采用传统的选择标记(新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因、链霉素磷酸转移酶基因)进行筛选,一般需6~8周或更长的时间才能鉴定出潜在的转基因苗,并需经过漫长的再生植株过程后进行Southern杂交分析,最终确定转基因植株,整个过程花费时间长。况且传统的选择性标记基因具有潜在引发“基因逃逸”或产生“超级杂草”等生态安全性问题,因此,对转基因植株的筛选迫切需要一种更为安全、可靠、省时的标记基因。GFP基因凭借自身优点而成为研究人员的选择对象。1997年,Chiu用突变型GFP基因转化拟南芥菜原生质体,成功使GFP基因在原生质体中得以瞬时表达。HuW等利用电击和PEG法将野生型GFP基因转化玉米原生质体,也成功的在再生转基因植株中检测到了绿色荧光。更具有筛选优势的是,Ponappa等利用GFP基因结合特定的抗生素基因对大豆胚性悬浮细胞进行双标记,并使两者在大豆悬浮细胞内获得了稳定表达。GFP基因与某些特定抗生素基因的结合使用,即可发挥荧光分检技术分离得到转化成功的单细胞,避免转化嵌合体的出现,同时,又减少了转化过程中的基因逃逸,从而大大提高了筛选效率。在利用GFP基因筛选转基因植株试验中,转基因植株本身的叶绿素在绿色荧光蛋白激发波长范围内也会产生自发荧光,从而掩盖GFP的荧光,易产生假阳性。因此,所用GFP基因需在植株体内能够高效表达,以消除背景荧光的干扰。再者,在对某些植株的筛选试验中发现,GFP对这些植株细胞产生了一定的毒害或抑制作用,因此,在GFP基因的应用中,还应充分了解所研究植株的背景。1.2gfp基因与生物敏感器的融合各种植物病害的发生都具有一定的时间性,并需一定的环境条件,在这些病害的防治中,若采用传统的方法待植株发病后再进行治理,往往错失防治的最佳时期。因此,对病原体的早期诊断往往关系着防治植物病害的成败。为了确定病原体的作用时间和所需的环境条件,利用GFP对植株生理特性无影响,且生成的荧光又可遥感检测的特点,若能将GFP基因与特定的启动子相融合,构建针对某一病原体的生物敏感器,通过对表达的GFP进行适时检测,便可及时了解病原体的侵染时间及当时的环境情况。在GFP基因应用前,Burlage,Selifonova等曾分别构建出了以荧光素酶(LUX)为指示的检测环境中萘和汞的生物传感器。直到2003年,MitraKooshki采用可被病原体诱导表达的gnl启动子与GFP基因构建了植物病害的预警植株(植物生物敏感器)。从试验的预警效果看,在植株8星期或更小时,GFP的表达量常难以检测,且即使在荧光分光光度法检测中有荧光信号,信号也不强。此植物敏感器的缺点在于,所用gnl启动子的诱导表达过分依赖于植株的生长时间,所以,在对植株生长早期就具有侵染能力的病原体的检测时,往往起不到预警的作用。另外,植株本身背景荧光也会影响到检测的准确度。尽管MitraKooshki的试验没有取得预期的效果,但它对利用GFP检测植物病害方面提供了宝贵的经验和探索。1.3gfp基因测序在植物病原菌与寄主相互作用的研究中,常用荧光素酶基因(lux)和β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)等作为报告基因进行跟踪检测,但荧光素酶检测时需向试验材料内渗入荧光素;而β-葡萄糖苷酸酶进行组织化学分析时,又需要昂贵的反应底物4-甲基伞形花酮-B-D-葡萄糖苷酸(X2Gluc),并且两种报告基因检测方法对病原菌都具有破坏性,在进行组织处理时也会阻断植物病原菌的继续侵染。因此,在病原菌侵染寄主植株途径的研究中一直未取得可靠的实时实态过程。绿色荧光蛋白基因(gfp)由于片段小,可与多种不同蛋白质的N端或C端相融合,非常适合于复杂生态环境中活细菌对植株的侵染及与寄主互作的跟踪研究。早期,Heilein等曾将GFP基因与TMV病毒的移动蛋白基因相融合,使其在原生质体中表达,然后与野生型相比较验证GFP基因标记的可行性。实验表明,GFP融合蛋白的定植位置真实反映了野生型移动蛋白在植株中的分布。此后,Epel等同样成功将GFP基因与烟草花叶病毒运动蛋白基因相融合,在感染的烟草中观察到了此病毒运动蛋白与宿主细胞肌动蛋白的结合及病毒运动蛋白通过胞间连丝,完成细胞间侵染循环的精细过程。郝敏等利用GFP基因标记水稻白叶枯细菌,观察了白叶枯细菌对水稻的侵染情况,实验同样证明了用标记有GFP基因的白叶枯细菌来观察它侵染水稻过程也是可行的。然而,在某些GFP融合蛋白中,虽然GFP因坚固的桶状结构的保护,自身荧光特性不受影响,但被标记蛋白的功能特性会因与GFP的连接而受到影响。因此,在进行GFP与目的蛋白的融合实验时,应充分了解所用蛋白的功能结构及相关的信息背景,以保证GFP标记不影响天然蛋白的正常功能。1.4gfp基因标记菌体的生长特性植物病原菌的定植研究是进行细菌性土传植物病害防治中众所关注的问题。因为只有对植物病原菌的定植部位、定植方式有了充分的了解才能更好的进行防治。同样,生防微生物的良好田间定植能力也是生防菌稳定发挥防效的重要前提。因此,病原菌和生防菌在植株上的定植研究变的尤为重要。Bloemberg,Normander等分别利用GFP基因标记了荧光假单胞菌(Pseudomonas.fluorescens),研究发现,经标记的菌体可在植物的根表处形成菌落,并可利用绿色荧光跟踪观察标记菌体在植株根部的生长与活动状况。张昕等将标记有GFP基因和氯霉素抗性基因的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和BacillussubtilisZJY-116中,研究了两者在黄瓜根围的定植规律,结果表明,在整个生育期两株生防菌株均能在黄瓜根围有效定殖,并在黄瓜盛花期和盛果期出现标记菌体数量高峰。吕泽勋利用GFP基因标记产酸克雷伯氏菌SG-11,采用在限菌条件、沙培和盆栽等方法研究了该菌在水稻苗根部的定植规律。试验结果显示,在限菌条件和沙培条件下,水稻根部的伸长区和根毛区多有标记菌定植,而盆栽植株根部没有发现标记菌的存在。从以上试验中可以看出,GFP基因的标记没有改变菌体的生理特性,并有效观察到菌体在寄主上的整个活动规律,但在应用中,需要解决的是所用质粒载体的稳定性问题,至少在实验研究的时间内所用质粒应是稳定的。RK2质粒一直是质粒稳定性遗传研究的关注对象。该质粒在没有选择压力的情况下,能在革兰氏阴性、革兰氏阳性细菌和酵母菌等微生物体内稳定存在。对此现象,己查明是因该质粒存在一个3.2kb的par区域控制它的稳定性。Weinstein等将RK2上的这段控制区域克隆到质粒pTR100中构建出pTRl02,然后通过接合转移导入菌体,试验结果表明,pTR102在转接100次后仍未见有质粒丢失。这一试验的成功为构造稳定的携带GFP基因质粒以研究病原体与寄主植株互作提供了工具。在另一试验中,为避过因质粒所带来的问题,Dunn曾构建了一个以mutgfp2为报告基因的蜡质芽孢杆菌启动子探针载体,通过鸟枪克隆法获得一个gfp组成型表达的克隆44-12,并在激光共扫描显微镜下检测到了它在番茄幼苗根表面的定植情况。1.5gfp基因与香蕉致病基因的融合由于GFP缺乏酶促扩大效应,在基因表达活性的研究中,可将GFP基因与病原菌的某些基因相融合,通过观察GFP基因表达的前后顺序及荧光的强弱,确定病原菌在感染植株中各基因的表达强度及各自的表达顺序情况,从而了解各基因在病原菌致病中的作用。PeterJ首先报道了GFP基因与香蕉病原体Mycosphaerella致病基因的融合转化实验。实验中将php基因和GFP基因受控于启动子gpd,构造gGFP质粒,然后将其导入Mycosphaerella的三个菌株感染香蕉叶片。实验利用GFP的表达情况确定出了三菌株对香蕉致病力的强弱,并表明对菌株的转化过程没有影响真菌的致病基因和其致病性。1.6gfp基因测年利用及转座子研究GFP的检测不需要任何辅因子,也无需对细胞进行处理,具有可原位实时检测基因表达的特性;而β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)具有较高的灵敏度,适用于研究菌体与植株互作中的物理定位。因此,Xi等将GFP基因的原位实时特点和gusA的空间定位效应相结合,构建了gfp/gusAminiTn5双功能转座子载体,用于进行环境和病原菌与寄主植株互作中的细菌基因表达及生态学方面的研究。另外,Errampalli等用GFP基因和luxAB分别标记两种假单胞菌并共同接种于被杂油酚污染的土壤,发现两种标记菌可以同时被检测,并在接种390天后的土壤样品中依然可检测到。从而为同时跟踪调查不同细菌在土壤中的生态及菌间的相互作用等方面的研究提供了可能。在与不同标记基因结合应用的同时,大量涌现的GFP突变体也为病原体研究的双重GFP标记甚至三重GFP标记开辟了新途径。2gfp衍生物增加了荧光蛋白基因的应用,使其“应当是一个危险的”GFP基因作为一种活体报告基因,其应用已深入到植物病害研究中的各个方面,从对植物病原体的侵染、致病机理的研究到在分子生物学和生态学等方面的应用,GFP都明显表现出其他报告基因不可替代的优点。上述介绍仅为GFP诸多应用中的一小部分,但足以说明GFP在植物病害研究中并不存在原则上的障碍。随着新一代GFP衍生物荧光信号的敏感性和蛋白的可溶性等的明显提高,GFP的应用还将进一步扩大。近些年,对荧光蛋白的研究,除从多管水母属中提取的荧光蛋白基因外,现在还从其他生物中提取了具有应用价值的荧光蛋白基因。Stratagene公司从海三色堇(Renillareniformis)提取构建了低毒性的重组GF