pcr技术检测种子携带病害的研究进展

pcr技术检测种子携带病害的研究进展

种子传播方法是一种通过种子传播方法传播的植物病害。病原体可以存在于用于播种材料的表面、内部或内外兼存,有的则以病原体直接混在种子之间。地球上90%左右的食用作物是以种子繁殖的,这些作物均受种传病害的侵害。种带病原是很多农作物病害的重要初侵染源之一,是引起作物在田间和在贮藏期发病的祸根。种子携带并传播病害是很多地区发生新病害的原因。种传细菌性病害有74种以上,理论上任何植物病原细菌都有可能由种子传播。菜豆晕疫病(Pseudomonassyringaepv.phaseolicola),1.6万粒种子中若有一粒带菌则可使菜豆晕疫病发生流行造成生产上的损失。因此,加强种子检测以减少、减轻病害的发生是十分重要的。下面对PCR技术在种传细菌检测方面进行较为详细介绍。1pcr检测种子带菌Mullis等在1985年创立的PCR方法已成为分子生物学及其相关领域的经典试验方法。此法灵敏、准确、方便、快速,可在短时间内扩增出数百万个特异DNA序列的拷贝,目前研究人员已在检测种子带菌方面应用PCR技术做了大量工作,设计得到了大量相关引物。例如,用于检测菜豆晕疫病的引物,检测番茄细菌性溃疡病(CMM)的引物等。多种以PCR为基础的分析方法,比如,以rDNA为模板的PCR:ITS-PCR、tRNA-PCR等都已经出现,利用特异引物的新方法使细菌性病害检测能力得到加强。根据PCR所扩增模板特点将PCR检测方法分类如下。1.1用特定基因和dna序列来确定疾病1.1.1筛选引物筛选使用特异引物PCR扩增与已知细菌致病性相关的片段来检测和鉴定病害是很有效的。例如,土壤杆菌属细菌(Agrobacterium)含有的染色体基因很复杂,可诱发很多病害,这些病害的明显症状是由根瘤诱导质粒或根诱导质粒的存在引起的。测得这些质粒基因序列,再找到相应引物进行扩增得到特异片段,达到检测目的。Haas等以高度保守的毒性D2基因的内切核酸酶编码区设计引物,特异性地检测Agrobacterium病原菌系。有的引物可以用来扩增出编码果胶酶的434bp的片段,这一片段与软腐病菌(Erwiniacarotovora)引起的软腐病相关。有的引物甚至根据控制果胶酶基因的不同序列可专一性鉴定亚种。包括黑腐变种(E.carotovorapv.atroseptia)、软腐亚种(E.carotovorasubsp.carotovora)、山俞菜亚种(E.carotovorasubsp.wasabiae),但不包括其它欧氏杆菌(Erwinia)种。还有的引物可以检测出马铃薯软腐病病原菌(E.chrysanthemi)。目前,乙烯形成酶(efe)基因,冠毒素生物合成基因都已被用作目的基因来检测病害。1.1.2rapd片段的设计无特性DNA序列也可被用于设计PCR引物。经常可以用某一物种中特有的DNA片段作为目标片段将其专一性地鉴定出来,这样的DNA片段序列就可以用于设计专一、灵敏的PCR基础上的检测方案。这样的无特性DNA包括克隆的RAPD片段、克隆的rep-PCR片段、负杂交片段、插入元素和无特性探针。但是这种目标序列对用于长期检测可能不理想,因为对无特性目标序列的可变性,稳定性的研究工作进行的还很少。1.1.3质粒pcll和pe2c9质粒衍生物的检测需要注意的问题是,同无特性DNA作目的片段相类似的,除致病性特点外,还要考虑质粒基因作为目的片段的稳定性。在有些情况下还要考察某一引物的适用范围。举例来讲,对于一个病原物种的检测有时只能检测到其中一部分,因为其种内有些毒性菌系不含目的质粒。对黄单胞杆菌属引起的菜豆疫病的检测就是这样。有的引物只能检测到番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganesissubsp.michiganensis)中75%的菌系。根据质粒Pcsl设计的类似启动子序列的引物对检测马铃薯环腐病中有质粒的菌系具有专一性,但对质粒缺乏菌系就检测不到了。但一套根据马铃薯环腐病(C.m.subsp.sepedonicus)质粒衍生物设计的特异性引物可以检测到所有C.m.subsp.sepedonicus菌系,包括一个用其它引物检测不到的可能不含质粒的菌系。一种根据pEA29质粒序列设计的引物可专一敏感的检测梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)。所有的被检菌系都含有这一目标DNA。这种质粒也许与适应性有关,因此能够在自然生长的梨火疫病病菌中存留下来。最后还有一种情况,在没有详细阐述基因及其产物的情况下,根据木薯枯萎病(X.c.pv.manihotis)(一种世界范围的检疫对象)中与致病性相关的质粒片段设计引物,从107个菌系中都可以得到一个特异的895bp的PCR片段,而在5种木薯枯萎病菌的非致病菌系及一些与这种黄单胞近缘的或与木薯相关的其它腐生菌都没有扩增产物。所以质粒DNA可作为一种可靠的检测和鉴定病害相关的病原物的检测目标。当然,掌握目标质粒DNA的本质特征和持久性将对利用质粒DNA检测方案的长期的可靠性大有裨益。1.2pcr分析以rdna为模式1.2.1srrna引物根据不同细菌的rDNA的不同特征有很多不同方案来对它们进行描述区分。个别的细菌可能含有1(支原菌)到14(梭菌属)个rRNA基因组,这些基因组不一定都是同源的。根据DNA保守区段设计的引物可用于从一个大的系统发育不同的细菌范围中扩增核糖体基因片段。已有充分的事实说明植物病原细菌当中由基因导致的rDNA特异序列的存在,并针对假单胞杆菌属、黄单胞杆菌属和许多检疫对象设计了相关引物。Widmer等用一套具有高度选择性的引物得到了假单胞杆菌16srRNA的基因片段。现已证明用这些引物对土壤假单胞杆菌的纯DNA进行PCR扩增是能够有效的得到目的片段的。Maes等推出一套能够扩增一个对黄单胞杆菌特异的480-bp的片段引物,通过结合一个通用的16srDNA引物和一个对黄单胞杆菌特异的反向引物能够检测小麦种子上的黄单胞杆菌。Takeuchi等测得6种布克氏菌和另外两种相关细菌种的16s和23srRNA基因间的整个区间序列并具此ITS带设计了专一性引物来检测水稻苗期病害的菌原物水稻谷枯病菌(B.plantarii)和水稻苗枯病菌(B.glumae)。最近有人利用16srRNA基因中单碱基对变异连接酶连式反应来特异性的检测斯氏细菌性萎蔫病病原Pantoea(Erwinia)stewartii。rRNA基因已被用来作为检测目的基因的DNA的高度敏感目标基因,但其区分能力目前还在种或属的水平上。很多PCR引物的特性使它们对其它PCR方案都很适用,象特异性很高的ITS-PCR。1.2.2sars基因的变异ITS-PCR分析利用根据保守16s及23s核糖体设计的引物来扩增转录间隔区(ITS)。在16s及23srRNA基因间的ITS区间可能包括一些tRNA基因和一些未编码区,因此较16s和23srRNA基因本身变异要大。用通用引物进行ITS-PCR时可以根据PCR产物的数量和长度检测和区分细菌。如果从一种细菌中扩增出的条带有变化,应是由不同rDNA长度变异引起的。实际上在多rDNA基因组中DNA的变异程度与近源菌系间的变异程度相等。可以通过限制性酶切分析ITS-PCR扩增产物或分析ITS扩增产物的DNA序列来增强特异性。Kim和Sony鉴定了7种水稻病害病原菌,包括假单胞菌属、黄单胞杆菌属和欧氏杆菌属中的种。方法是:先用通用引物扩增,获得16s和32srRNA基因ITS-PCR产物,然后设计特殊引物专一性的扩增ITS区。1.3sara基因末端tRNA-PCR方法是利用了tRNA-PCR基因的固有特性,tRNA基因常位于16s和23srRNA基因的ITS带或细菌5srRNA基因末端。从被扩增区段外侧设计一对引物对tRNA基因进行扩增,得到不同大小的扩增产物的指纹图谱,不同产物的产生就是由属或种的特异性造成的。Pan等结合tRNA引物Ala4和ITS的通用引物L1,从甘蔗白条病中扩增一个用于检测的360bp的片段,可以在待测样品中含1~5CFU的情况下检出病原物。2免疫pcr检测确定和分子鉴定医学免疫学及动物医学免疫学的不断发展促进了血清学技术用于植物病原细菌的检测研究。应用血清学技术检测植物病原细菌发展至今,对于植物病原细菌的检测已是一种较为成熟的技术。目前血清学技术与PCR相结合应用于病原细菌的检测,提高了检测的灵敏度。主要有两个大的方向:2.1免疫PCR(Immuno-PCR)免疫PCR技术是1992由SanoT.等最早使用的。该技术将血清学中抗原-抗体反应的特异性与PCR的强特异扩增能力结合起来,可以在短时间内精确的检测某一病原物是否存在。免疫PCR的原理是:用一段具体的DNA分子标记抗体,应用此抗体去检测抗原,PCR扩增此段DNA分子,根据扩增产物存在与否判断抗原是否存在。一般的操作过程是:在酶联板内包被用于捕获抗原的抗体,加待检抗原,再加DNA标记的抗体,然后PCR扩增抗原抗体复合物上的DNA片段,根据电泳结果判断抗原存在情况。此种做法类似于ELISA中的双抗体夹心法。根据反应物的不同,目前可将免疫PCR分为单分析物免疫PCR、多分析物免疫PCR、单引物免疫PCR、和双引物免疫PCR。2.2免疫磁性分离-PCR(IMS-PCR)磁性免疫微球(immunomagneticmicrosphere-IMMS)是近年发展起来的一类新型功能性材料,它是磁性微球载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的。由于磁性微球粒径一般很小,比表面积大,故而偶联容量较高,悬浮稳定性较好,便于各种反应高效而方便的进行;又因其具有顺磁性,在外电场的作用下固液相的分离十分简单,可省去过滤、离心等繁杂操作,并可在磁场作用下定位,方便地进行分离同配体相对应的物质。目前免疫磁性分离技术已应用于细胞标记、细胞分离、临床PCR检测等方面。应用于种子带菌检测的具体做法是:包括于IMMS上的抗体选择性吸附目标菌,洗掉未吸附的污染物(土壤颗粒、植物残渣和非目标菌);然后对目标菌扩增培养(此步也可省略),进行PCR扩增目的片段,根据所得结果判断目标菌是否存在。IMS-PCR的特点是对目的菌进行了二步检测,一是血清的作用,二是PCR的作用。这样在保证了检测速度的情况下,提高了检测的可靠性。在检测西瓜细菌性果斑病的试验中R.R.Walcott等证明了IMS-PCR的灵敏度比直接PCR高100倍,而且不受PCR抑制因子的影响。3检测灵敏度差随着国际贸易自由化程度不断加深,国际间农产品的交易日渐频繁,种子的进出口检疫工作显得日益重要。在这一方面,我国着实应当向发达国家学习,加强种子检疫研究。传统的检测方法,如:解剖检测法、洗涤检测法、分离培养检测法、荧光反应检测法、化学染色检测法、噬菌体检测法、生物测定检测法、离体培养检测法等,操作相对粗放;精确度低;耗时长;灵敏度差;需要多种方法配合使用。而电镜检测、实时PCR(RT-PCR)等精度较高、速度快(RT-PCR可以在采集到样品之后的1个小时内得出可靠检测结果)的方法,一方面仪器设备昂贵,另一方面对操作人员的技术水平要求也较高,如直接应用到实践中还存在一定困难。科学的发展尤其是免疫学和分子生物学日新月异的进步,将使用于检测种传植物病原细菌的方法不断突破旧的局