elispo检测人乳头瘤病毒感染后清除者外周血中抗原特异性记忆细胞

elispo检测人乳头瘤病毒感染后清除者外周血中抗原特异性记忆细胞

人类乳头瘤病毒（pv）是由嗜上皮组织的双链dna病毒组成的。HPV仅感染局部的皮肤和黏膜上皮细胞,不入血,因而外周血中抗原特异性T淋巴细胞的数量少,抗原特异性记忆T细胞的数量更少。本研究收集HPV自发清除者(病毒清除后74个月)外周血单个核细胞,抗原肽刺激后,采用ELISPOT方法,检测记忆T细胞分泌IFN-γ的能力,以明确外周血中记忆T细胞的数量和功能。该结果可为后续检测HPV持续感染者或宫颈癌患者体内抗原特异性的记忆T细胞奠定基础。1材料和方法1.1il-2、ifn-单克隆抗体和生物素标记的结构表征RPMI1640培养基、人血清、Ficoll淋巴细胞分离液购自Fisher公司;Multiscreen96孔板购自美国Millipore公司;IL-2、IFN-γ单克隆抗体和生物素标记的Anti-IFN-γ单克隆抗体购自瑞典Mabtech公司;avidin-boundbiotinylatedhorseradishperoxidase购自VectorLaboratories公司;ELISPOT分析仪为CellTechnology公司产品。1.2方法1.2.1ficoll细胞分离HPV自发清除后74个月收集静脉血40mL,Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC),计数冻存。1.2.2细胞培养和il-2前期实验已经证实此病毒自发清除者体内存在HPV16E6133-142表位特异性T细胞。冻存的PBMC常规复苏,检测细胞活性,用含10%人血清的RPMI1640培养基(RP-10H)过夜培养细胞(浓度为2×106/mL)。收集后计数细胞,将细胞以1×106/mL/孔置于24孔板中,应用抗原肽(HPV16E6133-142;10μmol/L)刺激PBMC细胞,置37℃培养箱中培养。第3天,每孔加IL-2(1800U/mL)。第7天,每孔加含IL-2的RP-10H1mL。第10天,收集细胞,用RP-10H洗涤细胞,去除抗原肽和IL-2,RP-10H继续培养细胞。第11天,细胞计数后进行ELISPOT实验。1.2.3elispot法检测相关免疫因子t细胞中表达抗体的表达应用ELISPOT方法,以EBV转化的B淋巴母细胞系(lymphoblastoidcellline,LCL)作为抗原递呈细胞(antigenpresentingcells,APC),以HPV16E6133-142为抗原,检测未经抗原刺激的PBMC和经抗原刺激11d的PBMC中分泌产生IFN-γ的抗原特异性T细胞,同时设置阳性和阴性对照。ELISPOT步骤参考文献。用IFN-γ单克隆抗体(5μg/mL)包被Multiscreen96孔板,4℃冰箱中过夜。次日弃包被液,PBS洗3次。用含5%人血清的RPMI1640培养基(RP-5H;50μL/孔)37℃封闭2h。每孔加入50μLLCL细胞(5×105/孔)、50μLPBMC(5×104/孔),50μLHPVE6133-142(10μmol/L),实验设阳性(PHA)和阴性对照(RP-5H)。每一条件设3个平行孔。平板置37℃细胞培养箱中过夜。PBS洗3次后,加入生物素标记的Anti-IFN-γ单克隆抗体(1μg/mL),37℃孵育2h。PBS洗3次后,加入avidin-boundbiotinylatedhorseradishperoxidase,37℃孵育1h。PBS洗3次后,diaminobenzene显色。去离子水终止显色。ELISPOT分析仪计数斑点数量。计算每一条件斑点数量的平均值作图。2结果与分析2.1出现的细胞数常规复苏PBMC,过夜培养后,计数细胞,活细胞数为4.1×105,抗原肽刺激10d后,细胞数增加为4.2×106,为抗原刺激前细胞数的10.2倍。第11天,细胞数为4.65×106,为抗原刺激前细胞数的11.3倍。2.2apc知识的表达ELISPOT结果显示,PBMC中的记忆T细胞经抗原刺激后活化为效应细胞,能够识别APC递呈的抗原肽HPV16E6133-142,并分泌IFN-γ(图1)。而未经抗原刺激的PBMC不能识别APC递呈的抗原肽(图2)。通过计数斑点数量,推算PBMC中抗原特异性的记忆T细胞的频数。公式如下:记忆T细胞的频数=(计数抗原肽刺激孔斑点数量-阴性对照孔斑点数量)÷PBMC数量÷细胞增加倍数。此HPV自发清除者外周血中抗原特异性的记忆T细胞的频数为(69-30)÷(5×104)÷11.3=0.007%。3抗原刺激激活pbmc中的记忆t细胞机体内的初始T细胞识别抗原递呈细胞递呈的抗原后,可被激活,分化为效应T细胞。当机体清除抗原,效应细胞中的一部分可分化转为记忆T细胞。当再次接触相同抗原时,抗原特异性的记忆T细胞可迅速增殖分化为效应T细胞。相较于初始T细胞,记忆T细胞具有较低的活化阈值和较强的效应功能。因此在防止病原菌的再感染过程中,记忆T细胞反应迅速,功能强大,发挥重要作用。体外抗原刺激可活化PBMC中的记忆T细胞。本实验采用已经鉴定的表位肽HPV16E6133-142刺激HPV自发清除者(HPV清除后74个月)的PBMC,使其中的记忆T细胞增殖分化为效应细胞。通过细胞计数,发现抗原刺激11d后,细胞数量增加11.3倍,表明PBMC中含有HPV16E6133-142特异性的记忆T细胞,此T细胞经特异性抗原肽激活后,分化为效应细胞,细胞分裂增殖,数量增加。ELISPOT可以从100万个细胞中检测出单个分泌细胞,具有较高的可靠性、重复性及敏感性。本研究应用ELIS