人巨细胞病毒核酸检测标准操作程序

人巨细胞病毒核酸定量核酸检测原则操作规程（荧光PCR法）1.目的规范人巨细胞病毒(HCMV)核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，精确进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA分析。2.应用范畴使用中山大学达安基因股份有限公司人巨细胞病毒(HCMV)核酸检测试剂盒（荧光PCR法）和PEGeneAmp5700、ABIPrism7000、ABIPrism7700等仪器进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA检测。3.职责由PCR实验室制订程序文献，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。4.内容4.1实验原理和临床应用本品选用人巨细胞病毒珠（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp,运用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。本品用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者尿液、乳汁、血清或淋巴细胞中的人巨细胞病毒(HCMV)感染的检测，用于人巨细胞病毒感染的辅助诊疗和疗效监控，不用于血源筛查。本品检测成果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的根据。标本采集4.2.1使用标本类型：尿液、乳汁、血清和淋巴细胞4.2.2标本采集；由合作单位按照下列规定进行采集。4.2.2.1尿或乳汁：取晨尿或成熟乳1ml于1.5ml的无菌离心管中，离心取沉淀即为标本。标本可立刻用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。4.2.2.2血清：用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml,注入无菌1.5mlEppendoff管，4℃静置过夜。吸取上层血清（注意勿带入红细胞）至另一无菌1.5mlEppendoff管中，即为血清标本。标本可立刻用于测试（48小时以内），也能够保存于-20℃待测，保存期为6个月。4.2.2.3淋巴细胞：取静脉血（EDTA抗凝）1ml,运用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞即为标本。标本可立刻用于测试，也可保存于4℃待测，保存期为24小时。4.3试剂准备4.3.1供应商：中山大学达安基因股份有限公司4.3.2此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立刻放回冰箱-20℃。4.3.3如果试剂出现了封口蜡破损造成液体外漏以及过期试剂，应及时更换。4.4质控品4.4.1质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。4.4.2质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。4.4.3质控频度：每次实验均需做质控。4.5操作过程阐明4.5.1DNA提取4.5.1.1质控品解决：分别取出阴性、阳性质控品，8000rpm离心数秒，各吸50ul至1.5ml灭菌离心管中，瞬时离心后95℃干浴2min，立刻冰浴2-5min后13000r/min离心1min，上清液用于PCR扩增。4.5.1.2样本解决4.5.1.2样本解决4.5.1.2.1取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；4.5.1.2.2取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；4.5.1.2.3将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；4.5.1.2.4rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；4.5.1.2.5吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，1rpm离心5分钟；4.5.1.2.6去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充足混匀，100℃恒温解决10±1分钟；1rpm离心5分钟，上清备用。4.5.2加样:从4℃冰箱取出解决好的样本以及质控品转移至加样区，取上清液5ul加至PCR反映管进行PCR扩增。4.5.3Mx3000P荧光定量PCR仪的设立及成果分析4.5.3.1打开计算机电源。4.5.3.2将Mx3000P电源开关打开，在大概1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件，拟定软件界面右下面的联机标志呈现绿色。如果不是绿色而是红色，软件会提示，这时只需要继续稍等半晌，待仪器自检完毕，会自动连接计算机。4.5.3.3在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，普通选择第一项“QuantitivePCR（MultipleStandards）”进行绝对定量分析。4.5.3.4拟定卤钨灯已经打开。(绿色)则阐明卤钨灯已经打开；（黄色）则阐明卤钨灯正在预热；（红色）则阐明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。在卤钨灯已经被打开的状况下，软件界面右下方会显示（绿色）。4.5.3.5最佳在仪器与光源预热20分钟后开始实验。4.5.3.6在里，对所选孔进行设定，在Welltype中设定Standard（原则品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择对的的荧光通道（FAM,HEX,ROX，Cy5），参比荧光（Referencedye）选None。对于原则品，在Welltype中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。办法为：点击，10倍的浓度梯度能够直接点击，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为原则品的另外几个孔，浓度将实时显示。也能够直接点击原则品的各个孔位，在一栏，手工输入浓度。若要对不同的样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。或者点击版面右上方的，导入以前使用的96孔板设定。4.5.3.7点击，进行PCR循环的设定，能够直接点击温度、时间变化各项温度、时间、循环数等。在选定大环节之后添加环节可选定该大环节后，点击，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择AddSegment，则可在该大环节之后添加一种大环节；若是在选定大环节里面的小环节后边添加一小环节，选中该小环节，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“AddPlateauwithRamp”。

要删除某个大环节，直接选定大环节，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该环节。如果要删除一种大环节里的小环节，可先选定此环节时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该环节。点击，导入以前设定的PCR程序。

（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全过程都采集荧光信号，普通用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。若要去除，可将其拖出循环设定区域。4.5.3.8结束之后，点击软件界面右上方的。会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“立刻运行”或者是“灯预热完毕后再运行”？普通可直接点击“立刻运行”，但最佳点击“灯预热完毕后再运行”，能够保护灯源。

软件界面右下方会出现运行状态显示框RunStatus，点击Start开始实验。在运行过程中能够通过点击AddCycles来增加扩增的循环数。还能够选择勾选“Turnlampoffatendofrun”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。4.5.3.9在PCR运行的过程中能够点击，观察样品的实时扩增原始成果。4.5.3.10PCR运行结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行成果分析，也可点击手动进行成果分析。能够手动调节阈值线（拖动）进行分析。点击可显示原则曲线，看斜率、截距、线性有关与否在可控范畴内。左下角的可选择对应的荧光观察扩增曲线。右边的可根据自己的需要选择显示的界面。是扩增曲线，Ct值列表，原则曲线，样本起始浓度，成果excel表格输出，合并面板，涉及设立、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。4.5.3.11分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的Smoothing对曲线进行调节，普通Amplificationaverage是3，可按需要将其调至较大数值，如5、7、9，调节后曲线将更光滑，但是Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，普通状况下，不建议这样做。4.5.3.12如果需要对每条曲线进行单独的基线设立，点击中的BaselineCorrection，点击Adaptivebaseline，在下面对应的各孔，单独进行基线起始和终止位置的调节。4.5.3.13有关Mx3000P调用前一次实验原则曲线的补充阐明。点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择MultipleExperimentAnalysis（多项实验成果分析）选项，点击“OK”，出现以下对话框，建议选择“Usecommonthreshold”进行分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文献，点击“Finish”即可。4.5.3.14这里选择时要注意：1.两个或者多个实验成果要有相似的实验程序；2.每次程序中的循环数应当一致。在分析栏能够选择不同实验的不同反映孔进行同时分析。4.5.3.15分析质控成果：阴性质控品：GBS(FAM)Ct值=40或“NoCt”，内参考（HEX）Ct值<40，且有较好的对数增加曲线。阳性质控品：GBS（FAM）Ct值<33，且有较好的对数增加曲线；内参考（TexasRed）Ct值≤40。以上规定需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。4.5.3.16统计实验数据。4.5.3.17取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以避免扩增管破裂而造成污染。4.5.4Roche480荧光定量PCR仪的设立及成果分析4.5.4.1先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。4.5.4.2双击图标“”，启动罗氏480软件。4.5.4.3在弹出的对话框中，输入顾客名和密码，进入软件设立界面。4.5.4.4在弹出的界面中，点击“”，进入新的实验设立界面：。4.5.4.5在“”菜单栏里，“”子菜单下。4.5.4.6将“DetectionFormat”选择为Daul或3color的探针杂交类型。4.5.4.7将“ReactionVolume”设立为“50ul”。4.5.4.8在“Programs”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性→延伸→退火”循环阶段的“AnalysisMode”下选择Quantification。4.5.4.9在“TemperatureTargets”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小环节，并在采集荧光的小环节的“AcquisitionMode”里选择“single”，采集荧光。4.5.4.10在“”菜单栏下，通过“”增加或者减少实验项目类型，通过右边的孔位选择，设立不同项目的区域，然后点击“Apply”保存。4.5.4.11在“”菜单栏下，Step1处，选择“AbsQuant”；Step2处，编辑原则品及样本。4.5.4.12原则品设立：在Step2下的96孔面板中，选中原则品反映孔，然后选择右侧的模板检测通道，如“483-533”，然后将下方孔位的“QuantificationSampleType”选择为“Standard”，并在“Concentration”处输入其浓度即可。4.5.4.13样本设立：类似于原则品设立，但仅需要编辑其“SampleName”即可。4.5.4.14返回“”菜单，在“”子菜单右下角点击“”，运行实验。4.5.4.15实验结束后，在“”菜单下，选择“AbsQuant/FitPoints”，进入成果分析界面：【Analysis】：在此菜单下对阈值线进行调节；【NoiseBand】：对实验的信噪比进行调节；【FilterComb】：对不同荧光通道进行选择；【StdCurve】：对定量参考品进行选择，涉及实验中的参考品、导入的原则品等；4.5.4.16在上述操作完毕后，点击“”；在“”菜单中，根据需要选择报告中需包含的项目，然后得出成果。4.5.4.17分析质控成果：阴性质控品：GBS(FAM)Ct值=40或“NoCt”，内参考（HEX）Ct值<40，且有较好的对数增加曲线。阳性质控品：GBS（FAM）Ct值<33，且有较好的对数增加曲线；内参考（TexasRed）Ct值≤40。以上规定需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。4.5.4.18统计实验数据。4.5.4.20取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以避免扩增管破裂而造成污染。4.5.4.21关闭扩增仪电源和计算机电源。4.6成果鉴定GBS阳性：（GBS-FAM）Ct≤33，且有较好的对数增加曲线。内参考（HEX）Ct值≤40。GBS阴性：（GBS-FAM）Ct值=40或者“NoCt”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI7500)，内参（HEX）Ct值＜40，且有较好的对数增加曲线。GBS检测灰度区：（GBS-FAM）33<Ct样本<40，因实验存在系统及人为不拟定性因素，应重复检查确认。4.7参考值：阴性。4.8注意事项4.8.1PC