jaksa通路和erk12信号转导通路交互作用对大鼠心肌p-sa3及nf-蛋白含量的影响

jaksa通路和erk12信号转导通路交互作用对大鼠心肌p-sa3及nf-蛋白含量的影响

根据研究，juk-stat信号通道在心肌缺血压损失中起着重要作用。考虑到i-r信号调节机制非常复杂，它在多个环节和层次上相互作用，因此，它与其他信号通道的交互作用仍需进一步研究。肿瘤坏死因子（TNF）-α作为主要的炎症细胞因子，对I/R损伤的病生理发展过程可以产生多种生理效应。本研究拟观察应用JAK通路抑制剂AG490、ERK1/2通路抑制剂U0126对大鼠离体I/R心肌进行多因素干预，旨在探讨JAK/STAT、ERK1/2两通路在其中的交互作用，并观察其对p-STAT3表达及TNF-α蛋白含量的影响。1材料和方法1.1分组及治疗方法清洁级雄性SD大鼠40只，体质量220～250g，随机分为5组，每组8只。即健康对照组（A组）、缺血再灌注组（B组）、JAK抑制剂AG490组（C组）、ERK1/2抑制剂U0126组（D组）、两通路抑制剂AG490+U0126交互作用组（E组）。1.2单克隆抗体、tnf-酶联免疫吸附试验和tnf-酶联免疫吸附试验常用试剂均为上海生工产分析纯试剂，AG490(Sigma）,U0126(Sigma），磷酸化STAT3单克隆抗体（SantaCruz），辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体IgG(Jackson）,TNF-α酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（晶美公司），Langendorff离体灌注模型（成都仪器厂），BL—410生物信号采集系统（四川泰盟仪器），电子天平（上海良平仪器），-70℃低温冰箱（Sanyo）。1.3心脏生物指标检测o实验前腹腔注射肝素500U/kg抗凝，30min后，以3%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉后迅速开胸取出心脏置于4℃的K-H液中，分离出主动脉并修剪心脏，开启离体心脏灌流装置（灌注压为70cmH2O，速度7～10ml/min），显微器械提起分离出的主动脉，将心脏悬挂于Langendorff离体工作心脏灌流装置上并用动脉夹固定，再次修剪附带胸腺等组织，在主动脉瓣及冠状动脉开口上方打结固定。剪去左心耳，将测压管乳胶水囊端经切口、左心房、二尖瓣插入，连接生物信号采集系统，调节水囊使左心室舒张末压(LVEDP）达到7～10mmHg、收缩压（LVSP）≥80mmHg、心率≥250次/min时，记录心率（HR）、LVSP、LVEDP。待心脏稳定搏动15min后，关闭灌注系统，给予4℃ST.Thomas停搏液（停搏液剂量为20ml/kg）。心脏停跳全心缺血30min后恢复37℃含氧K-H液再灌注30min,HR恢复稳定实验终止，留取心肌标本进行指标检测。1.4j公司对st.关于停灌的绩效进行及排放的控制健康对照组不停跳，麻醉后切开胸腔取正常心肌组织；缺血再灌注组麻醉后切开胸腔取心脏给予常规K-H液灌注15min，待其稳定搏动后，予以ST.Thomas停搏液持续泵注，停灌30min，复灌30min;JAK抑制剂AG490组给予ST.Thomas停搏液+AG490灌注，其余步骤同缺血再灌注组；ERK1/2抑制剂U0126组给予ST.Thomas停搏液+U0126灌注，其余步骤同缺血再灌注组；两通路抑制剂AG490+U0126交互作用组给予ST.Thomas停搏液+AG490+U0126灌注，其余步骤同缺血再灌注组。停搏液剂量为20ml/kg。1.5sds-培养取-70℃冻存的大鼠心肌组织标本，Lowry法测定蛋白浓度制成蛋白含量相同的样品，取20μl蛋白样品行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）电泳。电泳完毕后，将蛋白转移至PVDF膜，常规5%脱脂奶粉封闭2h、洗膜后滴加p-STAT3单克隆抗体（1∶1000）、4℃孵育过夜，洗膜后以辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体IgG(1∶1000）室温孵育2h，二氨基联苯胺（DAB）显色，用凝胶分析仪进行扫描、LabWorks分析系统软件图像分析[蛋白质含量以条带A值×面积（A×mm2）表示]，计算目的条带的积分A值。1.6心肌组织匀浆制备取缺血区心肌组织，用4℃0.9%生理盐水反复漂洗后剪碎，冰浴匀浆，后用与之前相同的生理盐水作为匀浆介质制成10%心肌组织匀浆，离心15min，转速4000r/min，取上清液-70℃冰箱保存，按TNF-αELISA检测试剂盒操作说明书进行，测得TNF-α含量。1.7统计处理实验数据以x±s表示，采用析因设计方差分析，组间进行多重比较，SPSS13.0统计软件分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1ag490对lvsp的影响复灌末，与健康对照组相比，其余各组HR、LVSP指标明显降低。与缺血再灌注组相比，AG490组及AG490+U0126组的HR、LVSP显著增高，AG490组LVEDP指标明显降低，且AG490组HR、LVSP高于AG490+U0126组。与缺血再灌注组相比，U0126组差异无统计学意义。见表1。2.2pstat3蛋白表达水平与缺血再灌注组相比，AG490组及AG490+U0126组pSTAT3蛋白表达均显著降低。与AG490组相比，AG490+U0126组p-STAT3蛋白表达量升高。见图1。2.3血再灌注组与ag490.0.0.6细胞培养对tnf-蛋白含量的影响与健康对照组相比，心肌组织TNF-α含量在缺血再灌注组显著升高（P<0.01）。与缺血再灌注组相比，AG490组及AG490+U0126组的干预后TNF-α蛋白含量明显下降（P<0.01,P<0.05），且2组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。与缺血再灌注组相比，U0126组干预后TNF-α含量差异无统计学意义（P>0.05）。3转录因子磷酸化心肌I/R损伤的主要表现有心肌细胞的炎性反应，甚至凋亡、坏死，心功能的下降以及心律失常等，其损伤机制相当复杂。而其中的细胞信号网络调节更是涉及到细胞外信号分子、细胞膜上信号接收器、细胞内信号转导通路及其效应等多方面的变化，且在多层次和诸多环节存在交互作用。JAK/STAT信号通路是细胞因子信号转导的重要途径，涉及免疫、细胞增殖分化、凋亡，炎症、肿瘤等多种生理、病理生理过程。JAK家族中已发现4种激酶，即JAK1～3和TyK2。STAT作为JAK的靶蛋白，是存在于胞质中的一个转录因子家族，包括7种成员即STAT1～4、STAT5a、STAT5b、STAT6。胞外信号通过相应受体激活JAK，使受体上特定的酪氨酸残基磷酸化，然后与STATs结合并使其磷酸化，磷酸化的STATs与受体分离，二聚化后转位到核内，结合到特定的DNA反应元件，启动相应的基因转录，促进多种蛋白合成，发挥生物效应。而ERK1/2信号途径属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinase,MAPK）相关通路之一。是公认与细胞增殖、分化和凋亡调控密切相关的细胞内信号转导酶类，同时参与心肌缺血再灌注损伤的细胞凋亡的信号转导。缺血、缺氧、细胞因子等各种刺激都可引起Raf-MAPK的磷酸化连锁反应而最终激活。活化的MAPK转位入核后引起转录因子磷酸化，提高应激蛋白基因转录水平，合成相关蛋白质，最后发挥心肌保护作用。本研究发现，JAK通路抑制剂AG490处理后再灌注末期大鼠心肌功能收缩、舒张功能等指标明显好于缺血再灌注组，而同时使用ERK1/2通路特异抑制剂U0126在抑制原有通路的同时也减弱AG490处理后对心肌功能的保护作用，但是单独以ERK1/2通路抑制剂U0126处理后对照缺血再灌注组差异无统计学意义。通过对JAK通路下游P-STAT3蛋白的定量分析，交互作用组U0126可与AG490产生影响，导致JAK通路下游P-STAT3蛋白含量明显上升。以往研究表明，TNF-α在I/R的病理生理过程中起着重要的作用。作为炎症级联的始发因子，参与释放弹性蛋白酶和氧自由基等，并使炎症信号产生级联放大作用，直接损伤内皮细胞，使毛细血管通透性增高。另外，现已明确TNF-αmRNA启动子上含有STAT3结合位点，抑制STAT3的活化可降低TNF-αmRNA的转录水平。在本研究中，与健康对照组相比，心肌组织TNF-α含量在缺血再灌注组有显著升高。与缺血再灌注组相比，AG490组及AG490+U0126组的干预后TNF-α蛋白含