x射线衍射分析在dna双螺旋结构中的应用

x射线衍射分析在dna双螺旋结构中的应用

在韦森和科克斯发现脱氧核酸（d.w.）的双螺旋结构之前，d空间结构的测定主要通过分析d纤维的x线衍射图案来确定。在本文中，我们介绍了早期物理育种家威克斯和化学家乌兰诺顿在开发纳米纤维x线衍射后的贡献、提供的证据、以及在发现纳米双螺旋结构方面的不足和差距的贡献。为了更好地理解上述实验工作，我们需要介绍dns化学结构的原理和x射线辐射分析的原理和方法。1dna结构1869年瑞士化学家米歇尔(FriedrichMiescher)在细胞核中发现了一种含有磷酸的奇特的物质,他把这种物质称为“核质”(nuclein).后来改名为核酸(nucleicacid).1880年德国生化学家科塞尔(AlbrechtKossel)开始了对核酸的生化分析,到19世纪末叶已从DNA中分离出4种碱基,它们是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶.1927年李文(P.A.T.Levene)从DNA中分离出脱氧核糖.到20世纪30年代已经确定了DNA的化学组成,它由4个称为核苷酸的基本单位组成,每种核苷酸又是由3种基本的亚单位,1个碱基,1个脱氧戊糖和1个磷酸基团组成.1950年查伽夫(ErwinChargaff)发现DNA中嘌呤类两个碱基之比例和嘧啶类两个碱基之比例随生物种类不同而大有不同.他又发现嘌呤类之总量和嘧啶类之总量相等,其中腺嘌呤之量等于胸腺嘧啶之量,鸟嘌呤之量等于胞嘧啶之量.1952年赫尔希(A.D.Hershey)和蔡斯(MarthaChase)利用放射性示踪物质对噬菌体侵染过程中分子事件的确切研究,表明了只有DNA(而没有蛋白质)参与了噬菌体颗粒复制的生化过程,说明DNA是遗传物质.DNA分子是由许多核苷酸分子连接而成的长链分子,在DNA中核苷酸是通过磷酸基团连接起来的(如图1所示).每一个核苷酸的脱氧核糖与另一个核苷酸的磷酸基连接在一起,形成糖-磷酸基骨架,构成了DNA的主链,这条主链决定了DNA分子的长度.虽然糖-磷酸基主链是很有规则的,其结构单元是彼此相同的,但它不是作为一个整体的分子,而只是DNA分子的一部分,因为每个糖有个附着在它上面的碱基,而这个碱基并不总是相同的,沿着这条链它们彼此遵循的顺序是有规律的.对各种DNA的化学结构而言,相互间的差别主要体现在所含碱基的组成、数量及排列顺序上.虽然我们从DNA的化学结构式知道它是一条链,但它自身并未告诉我们这个分子的形状,它的分子排列图形仍然不明.要进一步了解DNA的三维空间结构,有待于用X射线衍射法进行分析研究.2x射线衍射分析的概念、原理和方法2.1平面格点的选取晶体是由原子(或离子、分子)在空间中周期性重复排列的结构,把晶体中按周期性重复排列的那一部分原子,抽象成一个几何点来代表它,则这些表示周期性重复部分的点就构成了晶格.空间格点按照确定的平行六面体单位划分后,这些基本单位就称为晶格或晶胞.若整块晶体基本上为一个空间格点所贯穿,则该晶体称为单晶体.若晶体是由许多小晶体聚集而成,则称为多晶体.晶体的空间格点可划分为一族平行而等间距的平面格点,设一平面格点和三个坐标轴x,y,z相交(如图2所示),在三个坐标轴上截数分别为r,s,t(以a,b,c为单位的截距数目),截数之比可以反映出平面格点的方向.为了避免出现无穷数,规定用截数的倒数之比(1/r∶1/s∶1/t)作为平面格点的指标.由于格点的特性,这个比值一定可化成互为质数的整数之比1/r∶1/s∶1/t=h∶k∶l.所以平面格点的取向就用指标(hkl)表示.hkl称为晶面指数.图2中r,s,t分别为3,3,5,而1/r∶1/s∶1/t=1/3∶1/3∶1/5=5∶5∶3,则该平面格点的指标为(553).平面格点族(hkl)中相邻两个格点平面的间距用d(hkl)表示,h,k,l数值越小,面间距离越大.若三个指标包含公因子n,则表示这些面仅有1/n是通过格点的,而其余的平面是不通过格点的,这组平面指标为(nh,nk,nl),相邻两平面间距离为d(nh,nk,nl),而d(nh,nk,nl)=d(hkl)/n.图3示出d(110)和d(330)的关系,即d(110)=3d(330).用X射线结构分析法研究DNA的空间结构时,要根据样品的不同情况,采用不同物理状态的DNA样品,除DNA单晶外,还可以采用DNA纤维,DNA纤维在沿纤维轴方向都具有一定程度的有序取向.早期的DNA研究多采用DNA纤维样品.英国物理学家威尔金斯(MauriceWilkins)曾经生动地描述过核酸纤维的形态.1950年当他从事DNA胶凝体实验时看到:“核酸纤维在不知不觉中生出,每一次我用玻璃细棒和胶体相接触,提起来时就会有一条非常细(几乎看不见)的DNA纤维被抽出,很像蜘蛛的丝;纤维的完整性和一致性显示出其中所含的分子呈直线排列.我立刻就想到这些纤维如果用X光分析,就是最佳的研究材料.”2.2x-射线衍射1895年伦琴(W.C.Rontgen)发现X射线,它是一种波长范围在0.001~10nm的电磁波.用于测定晶体结构的X射线波长一般为0.05~0.25nm,这个波长范围与晶格面的间距大致相当.1912年劳厄(Von.Max.Laue)发现晶体X射线衍射,提出了劳厄方程.1913年布拉格(W.L.Bragg)把劳厄的思想加以简化,研究了X射线在晶格平面上反射时的干涉,得到了X射线衍射的基本规律.他认为X射线在晶体中被某些互相平行的平面所反射,当相邻平面上的原子在衍射X射线时所产生的光程差等于波长λ的整数倍时,将产生衍射最大值.设图4中相邻两个格点平面的间距为d(hkl),θ为X射线与此组晶面之夹角,则布拉格方程可表示为2d(hkl)sinθ=nλ(n=1,2,…)当波长λ一定时,对指定的某一平面格点族(hkl)来说,n数值不同,衍射的方向也不同,而n=1,2,3等衍射分别称为一级、二级、三级衍射.为了把不同级的衍射与不同的平面格点族联系起来,上式可以改写为2(d(hkl)/n)sinθ=λ如果引入虚拟间距为dhkl=d(hkl)/n的平面格点族,就可以将n级(hkl)衍射视为(nh,nk,nl)平面格点族的衍射.衍射指标hkl不加括号,不要求互质,可以有公因子,在数值上衍射指标为平面格点组指标(hkl)的n倍.因此,在X射线晶体学中,现在通用的布拉格方程的表达式为2dhklsinθhkl=λ(1)2.3倒易晶体中的定向为了解释晶体的衍射现象,我们要引入倒易格的概念.对于任一格点S,在衍射空间存在另一个倒易格S*.如果在晶体的晶格内之平移向量用a,b,c表示,在倒易晶格上相应的向量用a*,b*,c*表示,则其向量取向有下列关系:aa*=1,bb*=1,cc*=1,a*b=a*c=b*a=b*c=c*a=c*b=0如果一结构是处于某一晶格中,则其衍射图必然是处于与前者成倒易关系的另一晶格中.当晶体晶格中的平移向量彼此垂直时,则在倒易晶格中的平移向量将与晶体中相应向量平行,而其平移长度则与晶体中的相应长度成反比关系.这两个有关联的晶格的对称性总是一样的.2.4晶面上的衍射到晶面的垂直度回摆法是一种衍射照相法,它是DNA纤维的X射线衍射结构分析所用的主要方法.其设置如图5所示.用一束平行的单色X射线垂直照射DNA纤维样品,使DNA纤维样品绕纤维轴在一定角度内来回转动,照相底片放在以回转轴为中心的圆柱面上,拍摄衍射图.在衍射图上将出现许多平行而等距离的层线,层线上分布着许多衍射斑点.通常称中央层线为0层,从0层数起,上边第一层为+1层,第二层为+2层,下边第一层为-1层,依此类推.由于晶体回转,其中任一晶面与入射X射线所成的角总有机会满足布拉格方程,因而,在相应的方向有衍射线,在照片上得到衍射斑点.此衍射斑点应满足布拉格方程:2dhklsinθhkl=λ由上式可以看出,一组平面格点族的间距dhkl越小,则θhkl越大,层线的级次越高.回摆图上出现层线是由于回摆轴和晶体中的倒易格平面垂直.若晶体转轴和水平面垂直,晶体绕轴来回转动,倒易格平面始终保持水平,对应于第n层层线的hkn都处于同一个水平的圆周上,相应的衍射线和水平面的交角相等,因此在胶片上感光的hkn衍射点均落在和0层距离相同的层线上.2.5结构因子的描述1952年5月,克里克、科克兰(W.Cochran)和万德(V.Vand)在《结晶学报》(Acta.Crystallographica)上发表了题为《合成多肽的结构.1.在螺旋上原子的变换》的文章.他们推导出在沿着螺旋线等距离分布的原子在倒易空间(即衍射空间)中的傅里叶变换式,即一条光滑的单股螺旋在第n层线的结构因子的表示式为Tn=Jn(2πrR)exp[in(ϕ+π/2)](2)式中,Jn为n阶贝塞尔(Bessel)函数,r为螺旋的半径,而R和ϕ为倒易空间中的半径和方位角坐标.上式给出了在第n(n=1,2,3,…)层线上X射线衍射的振幅和相位,其振幅|Tn|=|Jn(2πRr)||Τn|=|Jn(2πRr)|具有轴对称性,而且随n的增加而迅速地减小.贝塞尔函数图形(见图6)表明一个均匀的连续的螺旋给出了一系列对应于螺距的带有间隔的层线,沿着第n层线的强度分布正比于Jn的平方.如果以结构因子Tn作为傅里叶级数的系数,计算所得的级数就是电子密度函数,用ρ(x,y,z)表示.如果以结构因子|Tn|2|Τn|2作为傅里叶级数的系数,计算所得的级数就称为帕特森(Patterson)函数,用P(u,v,w)表示.它的意义是指晶胞中x,y,z处的电子密度ρ(x,y,z)和(x+u,y+v,z+w)处的电子密度ρ(x+u,y+v,z+w)的乘积的体积分.3dna模型的建立20世纪20—30年代,X射线衍射已被用于纤维结构的分析.1938年英国晶体学家、曾任伦敦皇家研究所主任布拉格助手的阿斯特伯里(W.T.Astbury)首先把X射线用于分析核酸结构,获得了第一张X射线衍射图,并根据衍射图中子午线上出现的周期性的强反射,得出碱基处在垂直于纤维轴的平面上,并具有0.334nm间距的重要论断.1948年年底,挪威晶体学家,当时还是伦敦柏纳耳(Bernal)实验室的研究生的法贝格(SvenFarberg)建立了一个DNA结构的单螺旋模型,其中相邻碱基的间距为0.34nm,每个碱基绕着纤维轴旋进45°,在一个螺旋内共有8个碱基.20世纪40—50年代,剑桥大学的卡文迪什(Cavendish)实验室主要是作蛋白质的X射线衍射分析的实验,用X射线分析DNA结构的实验主要是在伦敦的国王学院(Kingue679sCollegeatLondon)进行.50年代初,沃森和克里克在构建DNA的模型时,主要的实验依据来自于伦敦国王学院的威尔金斯小组和富兰克林(RosalindFranklin)小组.后来沃森、克里克和威尔金斯3人共同获得了诺贝尔生物学奖,富兰克林却因早逝而未分享此奖.本节将介绍威尔金斯和富兰克林对DNA双螺旋结构的建立所作出的贡献.3.1dna结构的研究威尔金斯,1916年生于新西兰,在英国长大,1938年毕业于剑桥大学物理系.二次大战期间到伯克利加利福尼亚大学参与曼哈顿计划,从事用质谱法分离用于原子弹的同位素.战后,开始了用超声波、紫外线显微镜对生命物质的研究.1946年加入伦敦国王学院生物物理研究室工作.1950年开始用X射线衍射研究DNA的结构.1953年4月25日,沃森和克里克在《自然》杂志上发表了《核酸的分子结构——脱氧核糖核酸的结构》的著名论文,而威尔金斯与史道克斯(A.Stakes)和威尔逊(E.R.Wilson)也在同一日在该杂志上发表了《脱氧戊糖核酸的分子构造》一文.同年10月24日,为了进一步说明这项实验工作,他与席慈(W.E.Seeds)、史道克斯和威尔逊又在《自然》杂志上发表了《结晶的脱氧戊糖核酸的螺旋结构》一文.下面将通过介绍这两篇论文的基本内容来说明威尔金斯的贡献.3.1.1x-ct衍射图威尔金斯在1953年4月的文章中首先谈到了他写作这篇文章的目的是“初步描述具有螺旋形而且以自然状态的形式存在的多肽链构型(configuration)的一些实验证据”.他使用的样品是纤维状的DNA结晶体,并使其保持在潮湿状态.实验中DNA纤维和照相底片都放置在垂直于X射线束的方向上(图7).当单色X射线束垂直通过DNA纤维时,就像通过一个光栅一样,在照相底片上就会呈现明暗相间的X射线衍射图样.在衍射图上的纵轴和横轴分别以子午线和赤道线相称.在这篇论文中他使用的衍射图是富兰克林摄制的B型结构的DNA的X射线衍射图(图8).他指出:X射线衍射图照片是由两个区域组成的.一个是由沿着这条链的碱基的有规则的空间排列决定的;另一个是由这条长链的空间构型决定的.他说:“阿斯特伯里建议的这个强烈的0.34nm反射对应于沿着这条纤维轴中间的核苷酸的重复.然而这个约为3.4nm的层线并不是多核苷酸组成的重复,而是由于链条构型的重复.当核苷酸具有比较高的密度的时候就引起了强烈的衍射.在子午线上及附近反射的减少立即可以得出具有平行于纤维轴的螺旋结构.”这一段话说明了螺旋结构与衍射图间的相互关系,可作如下具体解释.如图9所示,设核苷酸(或碱基对)之间的间距为h,则h=0.34nm,在衍射空间(即倒易空间)中对应线段的长度h*=1/h=1/0.34,对应于衍射图上第10层线的衍射强度.设螺旋的螺距为p,则p=3.4nm,在衍射空间(即倒易空间)中对应线段的长度p*=1/p=1/3.4,对应于衍射图上第1层线的衍射强度.接着,威尔金斯用贝塞尔函数作了进一步解释.在1953年4月的论文中,他画出了在直径为2.0nm处分布有半数质量,而其余质量沿着径向分布的螺旋,在倒易空间中的贝塞尔函数的平方在层线上的分布曲线图(图10).他说:“一个均匀的连续的螺旋给出了一系列对应于螺距的带有间隔的层线,沿着第n层线强度的分布正比于第n级贝塞尔函数Jn的平方.通过每个贝塞尔函数最内部的最大值和原点画一直线,这条线与赤道线所成的角度大约等于螺旋元件与螺旋轴之间的角度.”他解释道:“在衍射图中在子午线及其附近反射的不存在,对应于图10中一个空白区域AAA,是这个螺旋结构的直接结果.而在衍射图中赤道及其附近的空白区域对应于图10中的一个空白区域BBB.”这就说明在衍射图上衍射强度最大值呈十字交叉分布是螺旋结构X射线衍射的最显著的特征.3.1.2结构的结构和组成在1953年10月发表的文章中,威尔金斯指出写作这篇文章的目的是“证明DNA是由两条缠绕在一起的多核苷酸链组成的”.图11是威尔金斯小组拍制的A型DNA的X射线衍射图.图12给出结晶的DNA在X射线衍射的倒易空间中衍射强度的二维图.图中黑色矩形的高度正比于结构因子,其面积正比于总强度.这条连续曲线与螺旋结构的结构因子相对应.关于螺旋的直径,他在前一篇文章中谈到在衍射图上强烈的衍射发生在1.7nm处,最大的直径为2.0nm.在本文中他从图12中第2层线和赤道上的衍射强度与螺旋直径为1.8nm的结构因子曲线的一致性,得出这个衍射是由严格规定的直径大约为1.8nm的螺旋产生的.他还得出螺旋的厚度不小于0.35nm.他又根据在第1、第3层线上的强度分布对应于直径为1.0nm的螺旋的结构因子,从而推出“在这两个直径为1.8nm的螺旋之间的空间内,还有一个直径为1.0nm的螺旋”.而这后一个螺旋形是由一系列碱基对排列的形式决定的.他还从A型DNA的X射线衍射图中,观察到唯一的接近子午线的反射在第11层线中心,由此,他推断出单股螺旋每一转包含有11个核苷酸.他还指出,在DNA不完全结晶的状态中,碱基处在螺旋轴的平面上;在结晶的状态中,碱基的平面倾斜于螺旋轴.他指出:“如果核苷酸大略是由与纤维轴成65°倾角的一系列平面形成的,衍射图上强度的分布就能得到解释.”威尔金斯还通过对DNA晶体的含水量和密度的测量,明确提出在DNA的螺旋结构中包含有两条链.他说:“我们的测量表明,每个DNA的结构单位有22个核苷酸,可以肯定在螺旋系统中有两条而不是3条核苷酸链,在一个螺距的长度内每条链上有11个核苷酸.”威尔金斯用大量的实验数据证实了沃森和克里克提出的DNA的双螺旋结构模型,并用具体的实验数据表示之.他得出结论说:“整条磷酸基-糖链大约处在距离螺旋轴0.9nm处,形成两条间距为1.4nm、直径为1.8nm的螺旋.一系列碱基对与螺旋轴大约成65°的倾角,在两个直径为1.8nm的螺旋之间,形成直径为1.0nm的单股螺旋(图13).这个模型作为一个整体与从X射线衍射数据推断出的结构对应得很好”.3.2x-射线衍射富兰克林,1920年生于英国,1941年毕业于剑桥大学物理化学专业,1941—1946年在英国煤炭利用研究学会工作,1947—1950年在巴黎国家化学实验室工作,研究X射线衍射技术,成为用X射线解决有机物构造问题的专家.1951年她被聘为伦敦国王学院的研究员,从事DNA纤维的晶体构型的研究.1953年4月25日她和戈司陵(R.G.Gosling)在《自然》杂志上发表了《钠DNA的分子构型》一文;同年7月25日又在《自然》杂志上发表了《在钠DNA的晶体结构中双链螺旋的证明》一文.下面将依据这两篇文章的内容阐述富兰克林对DNA双螺旋结构的建立所作出的贡献.3.2.1结晶方式b型结构在1953年4月那篇文章一开头,富兰克林就写道:“DNA纤维给出了两种不同类型的X射线衍射图.第一种对应的结晶形式是A型结构,它是在75%的相对湿度下获得的,已有学者在别处详细地描述了这项研究.在较高的湿度内另一种不同的结构是B型结构,显示出较低的结晶层次,其湿度保持在一个宽阔的范围内.形式A改变为形式B是可逆的.经受这种可逆变化的B型结构,水的含量可以从干重量的40%~50%变化到百分之几百.”3.2.2b型结构的螺旋结构富兰克林指出:“B型结构的X射线图(图8)以明显的样式显示出这个螺旋结构外形的特征.”接着她从B型结构的形成过程说明螺旋特征,“当DNA的含水量超过它的重量的40%的时候,就从A型结构变为B型结构.这个改变伴有纤维长度大约30%的增加和这个分子实质上的重新排列,因此在B型结构中DNA的结构单位基本上是不受相邻分子影响的.水的外壳保护了每个单位.于是每个单位不依赖它的相邻分子,自由地开始建立最少能量的构型,由于卷绕的长链分子的性质,很可能这个一般的形式就是螺旋.如果我们采纳螺旋结构的假设,从B型结构的X射线衍射图,按照螺旋的性质和大小,作出一定的推断是可能的.”她还从单股螺旋的结构因子的表示式出发,说明DNA结构的螺旋性质.她指出:“在第1、第2、第3和第5层线上最内部的强度最大值近似地位于从原点射出的直线上.”而这个“观察到的B型结构的强度最大值的线性阵列近似地对应于在结构因子中的贝塞尔函数J1,J2,J3,…等等中的第一个最大值.”3.2.3磷酸盐结构单位的确定富兰克林还从密度分布出发得出磷酸基-糖链在DNA结构外边的结论.她说:“因为这个最大值的线性阵列是X射线最显著的特征,所以我们必然得出结论:这个分子结晶学上重要的一部分处在这个螺旋的直径上,这只能是这个磷酸基团或磷原子.”接着又说:“如果10个磷原子在半径为1.0nm的螺旋的一圈上,在一个分子中两个相邻的磷原子的距离是0.71nm.这对应于在一个充分扩展的分子中一系列磷原子之间的距离,从而进一步表明,磷酸盐位于这个结构单位的外边.”她最后说:“如果这个结构是螺旋,我们发现磷酸盐基团或磷原子处在直径大约为2.0nm的螺旋上,而这个糖和碱基团必须相应地向内转向螺旋轴.”在1953年7月的文章中,她又补充说明道:“对密度和强度两者的考虑,导致我们更喜欢一个更为简洁的螺旋结构,在这个结构中磷原子位于半径大约为0.85nm的螺旋上,而不是1.0nm,这个值也处在层线峰值扩展的范围内.”3.2.4从加害者的关系看双链结构富兰克林在1953年4月的文章中说:“首先,使用叠加方法对A型结构的帕特森函数的研究,已经表明只有两条链通过这个结构中主要的单位细胞.因为A⇄B的变换是很容易可逆的,在B型结构中的这些分子以3条链的形式拧成一股似乎是很不可能的.第二,从B型结构的X射线图的测量,能够很容易地显示出每个单位的链条数或者是两条,或者是三条,沿着这条纤维轴这些链条并不是等间隔的.例如,三条等间隔的链条将意味着第n层线将取决于J2n,将导致直径大约为6.0nm的一个螺旋,这就比在A型结构中的主要单位细胞大许多倍,就核苷酸直径的大小而论是荒唐可笑的.在其他方面三条不等间隔的链条在晶体学上将是不等效的.这又再一次说明三条链似乎是不可能的,因此沿着这条纤维轴只存在具有不等间隔的两个同轴的分子似乎是可能的.”在1953年7月的文章中,她进一步提出在A型结构中两链分子的证据.她说:“对于A型结构我们已经测量了反射的位置和强度,已经计算了圆柱形的平均帕特森函数,其函数图形如图14所示.图中半径为0.90nm的光滑螺旋的帕特森函数的理论曲线如曲线(i)和(ii).在纤维轴上高度为c/2(c是螺距,c=2.8nm)处,很强的峰值显示出这两条链的磷酸盐基团近似由c/2的间距分开.显然,曲线(i)和曲线(ii)一起穿过大部分重要的帕特森峰值.”在这篇文章中,她还从DNA含水量的角度提出双链结构的证据.她说:“我们的测量给出了在75%的相对湿度时,或含水量大约为干重量的40%(或每个核苷酸大约包含8H2O)时的密度为1.47g/cm3.我们已经证实对于这些测量使用的样本是A结构的形式,而不是B结构的形式.这些结果对应于每个晶格有23个核苷酸,它是与原