生物高分子与有机物小分子探针的静态荧光1922-2000的荧光1922

生物高分子与有机物小分子探针的静态荧光1922-2000的荧光1922

作为一种重要的研究手段，f0f-1对生物聚合物的研究起着重要作用。关于小分子静态荧光摄影的理论，文献中有详细的报道。在以下条件下，提出了小分子之间的荧光摄影理论：当乍入剂（q）和荧光体（p）反应生成1:1的配合物时，且生成的配合物（p-q）不产生荣耀。因此，f0f1【q】f0f1，k，q）。因为生物聚合物和小分子之间的相互作用，它们的结合不是一个简单的1:1关系，而生物聚合物可以将n个小分子结合在一起。当一个小分子的相对浓度随着电子和微分子之间的变化而变化时，需要注意的是，在上述公式中，[q]是反应后突然暴露剂的平衡浓度，而不是直接暴露剂的原始浓度。当实际测量时，由于初始值[q]0和平衡浓度[q]之间的差异，因此上述公式不能用作定量测量的基础，但在实际测量中，由于[q]0和[q]之间的差异，使用[q]0是不科学的。近年来，随着生物聚合物的研究人员注意到了结合位点的问题，在文献中也报道了不同的相关公式。例如，1f0-f.1f0和1lbf0cqf0f=[q]f0（f0-f）-n[t]l（f0-ff）=la或nlg[q]f0f0-f.1n[q]等。这些关系在推理过程中考虑了生物聚合物和小分子之间的相互作用，但在1n的情况下，乍得剂的平衡浓度[q]与初始浓度[q]之间的差异，这是不科学的。鉴于上面存在的问题,本文在理论上推导了生物大分子猝灭有机物小分子荧光探针荧光的相互关系,并进行了实验验证.1实验部分1.1试剂及其配制方法RF-5301荧光分光光度计(Shimadzu.Japan).MettlerToledo320-S型pH计(上海).鱼精子脱氧核糖核酸(DNA,FishTestes,AMRESCO分装,上海生工生物工程技术有限公司)溶液:配制时将准确称量的适量试剂直接溶解在水中,定容至刻度,4℃储存.亚甲基蓝(MB,生物染色剂,上海试剂三厂)溶液:配制时将准确称量的适量试剂直接溶解在水中,配制成1.0×10-3mol/L的储备液,使用时逐级稀释.邻菲啰啉(phen,广州化学试剂分公司)溶液:配制时将准确称量的适量试剂溶于5mL无水乙醇中,然后用去离子水定容至刻度,配成1.0×10-2mol/L的储备液,4℃储存,使用时逐级稀释.环丙沙星(CPFX,化学对照品,中国药品生物制品鉴定所)溶液:配制时将准确称量的适量试剂用0.1mol/L的盐酸溶解,然后用去离子水定容,配成1.0×10-3mol/L的储备液,4℃储存,使用时逐级稀释.罗丹明B(RhB,上海试剂三厂)溶液和L-色氨酸(L-Trp,AMRESCO分装,上海生工生物工程技术有限公司)溶液的配制方法同MB.三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲液:0.05mol/L.荧光测定均在室温进行,所有化学试剂均为分析纯,所用生化试剂未经进一步纯化,水为去离子石英亚沸水.1.2荧光计和标准曲线mb的制备在10mL比色管中按顺序依次加入1.5mL0.05mol/LTris-HCl缓冲液,一定体积、一定浓度的MB(phen、CPFX、RhB、L-Trp)标准溶液,用去离子石英亚沸水定容至10mL,然后在荧光计上测定无DNA共存时MB(phen、CPFX、RhB、L-Trp)的特征荧光强度F0.同样,在10mL比色管中加入1.5mL0.05mol/LTris-HCl缓冲液,一定体积、一定浓度的MB(phen、CPFX、RhB、L-Trp)标准溶液,再加入待测的DNA溶液,反应10分钟后用去离子石英亚沸水定容至10mL,然后在荧光计上测定有DNA共存时MB(phen、CPFX、RhB、L-Trp)的特征荧光强度F.荧光激发和发射狭缝均为5nm,1cm×1cm液池.2结果与讨论2.1反应前后体系的荧光强度参数的计算有机小分子荧光探针包括吖啶类、罗丹明类、荧光素类染料等,其与生物大分子的荧光猝灭反应表达式为:nP+Q→Pn-Q(1)式中P为外源荧光探针,Q为生物大分子猝灭剂,讨论的前提是外源荧光探针与生物大分子作用位点结合后荧光完全被猝灭,则反应的表观结合常数表示为:Κ=[Ρn-Q][Ρ]n[Q](2)反应前体系的荧光强度值为浓度为[P]0的有机物小分子外源荧光探针的荧光强度,即F0=k[P]0(3)式中k为荧光探针的灵敏度参数,即探针本身的荧光值与其浓度线性关系的斜率.反应后体系的荧光强度值为浓度为[P]的有机物小分子外源荧光探针的荧光强度,即F=k[P](4)由浓度关系可得:[P]0=[P]+n[Pn-Q](5)[Q]0=[Q]+[Pn-Q](6)由式(3)～(6)可得:[Ρn-Q]=[Ρ]0-[Ρ]n=ΔFnk(7)[Q]=[Q]0-[Ρn-Q]=[Q]0-ΔFnk(8)[Ρ]=Fk(9)把公式(7)～(9)代入(2)得:Κ=[Ρn-Q][Ρ]n[Q]=ΔFnk(Fk)n{[Q]0-ΔFnk}=ΔFnkFnkn{nk[Q]0-ΔF}nk=knΔFFn{nk[Q]0-ΔF}(10)(1)生物探针反应在[Q]0≪[P]0的情况下,如果K值大到足以使生物大分子与荧光探针小分子的相互作用有意义,而且猝灭剂生物大分子的初始浓度[Q]0相对较小,则可认为猝灭剂完全反应,此时猝灭剂生物大分子各作用位点均与荧光探针小分子结合,在此前提下有:[Q]0≈[Pn-Q](11)则:[P]0-[P]=n[Pn-Q]=n[Q]0即:F0k-Fk=n[Q]0ΔF=nk[Q]0(12)在公式(12)中,由于k是定值,又由于[Q]0≪[P]0,可认为n近似为常数,则ΔF与[Q]0在一定的浓度范围内成线性关系.(2)在一定范围内成线性关系在[Q]0≫[P]0的情况下,如果K值大到足以使生物大分子与荧光探针小分子的相互作用有意义,而且荧光探针小分子的初始浓度[P]0相对较小,则可认为荧光体完全反应,此时荧光探针小分子趋向于被完全猝灭,则可假设:[Q]0≈[Q],[Ρn-Q]≈[Ρ]0n(13)将公式(7)～(9)和(13)代入(2)得:Κ=[Ρn-Q][Ρ]n[Q]=[Ρ]0n[Ρ]n[Q]0=F0nk(Fk)n[Q]0(14)由公式(14)得:Fn=F0[Q]0kn-1nΚ即:(1F)n=[Q]0F0nΚkn-1(15)将公式(15)两边取对数可得:lg1F=1nlg(nΚF0kn-1)+1nlg[Q]0(16)公式(16)中,由于k、K,F0是定值,又由于[Q]0≫[P]0,可认为n近似为常数,则lg1F与lg[Q]0在一定的浓度范围内成线性关系.在实际应用中,通常通过生物大分子猝灭高灵敏荧光探针来定量检测生物大分子,因此上述第一种情况更有实际意义.2.2有机小分子荧光探针体系的验证实验选择生物大分子鱼精子脱氧核糖核酸(HSDNA)分别猝灭亚甲基蓝(MB)、邻菲啰啉(phen)、罗丹明B(RhB)、环丙沙星(CPFX)、L-色氨酸(L-Trp)等有机小分子荧光探针体系,在最佳实验条件下,验证了上述理论推导结果.(1)生物补偿实验结果的线性范围图1为HSDNA摩尔浓度远小于MB的摩尔浓度条件下,HSDNA猝灭MB荧光的△F～[Q]0关系曲线和按照现有的小分子荧光猝灭理论所得关系式并混淆HSDNA初始浓度和平衡浓度所得的F0/F～[Q]0关系曲线.由图可知,依据本文理论推导所得的关系曲线在一定浓度范围内呈良好的线性关系,并可作为HSDNA定量测定的基础.而在相同的浓度范围,简单套用现有的小分子荧光猝灭理论所得关系式并混淆HSDNA初始浓度和平衡浓度所得的F0/F～[Q]0关系曲线则不存在线性关系.对HSDNA分别猝灭phen、RhB、CPFX、L-Trp荧光的实验研究结果均得到相同的结论.实验结果见表1.由此可以认为,在考虑生物大分子与小分子的作用位点数差异,严格区分生物大分子猝灭剂平衡浓度和初始浓度的基础上,在生物大分子猝灭剂初始浓度远小于小分子荧光探针浓度的条件下,所做的理论推导是正确的,所得关系式ΔF=nk[Q]0更能反映实际情况,因而更科学.由于实际体系通常是在生物大分子猝灭剂初始浓度远小于小分子荧光探针浓度的条件下,通过生物大分子猝灭小分子荧光探针的荧光进行生物大分子的灵敏测定,因而该关系式可以作为该类测定方法的定量测定基础,由此得到的测定结果具有良好的线性关系和较宽的线性范围.(2)生物补偿原理与标准曲线及关系式lg1/f[q]0关系曲线图2为HSDNA摩尔浓度远大于MB的摩尔浓度条件下,HSDNA猝灭MB荧光的lg(1/F)～lg[Q]0关系曲线和按照现有的小分子荧光猝灭理论所得关系式并混淆HSDNA初始浓度和平衡浓度所得的F0/F～[Q]0关系曲线.由图可知,即使是在生物大分子HSDNA摩尔浓度远大于MB的摩尔浓度条件下,简单套用小分子荧光猝灭理论所得的F0/F～[Q]0关系也不呈线性,而依据本文理论推导所得的lg(1/F)～lg[Q]0关系曲线则呈良好的线性关系.对HSDNA分别猝灭phen、RhB、CPFX、L-Trp荧光的实验研究结果均得到相同的结论.实验结果如表2所示.由此可以认为,在生物大分子猝灭剂初始浓度远大于小分子荧光探针浓度的条件下,所做的理论推导是正确的,所得关系式lg1F=1nlg(nΚF0kn-1)+1nlg[Q]0同样可以作为生物大分子猝灭剂初始浓度远大于小分子荧光探针浓度时的定量测定基础,由此得到的测定结果具有良好的线性关系