检测血液葡萄糖的方法

检测血液葡萄糖的方法

近年来，糖尿病患者的数量逐年增加。糖尿病主要表现为血液和尿液中葡萄糖含量的异常,目前的治疗方式主要是对病人体内的葡萄糖代谢进行调控,临床治疗给药的重要依据是病人的血液葡萄糖含量。目前医院中最常用的方法是通过采集病人的血样,处理后加入相关的化学试剂或酶试剂配置成溶液,反应后用大型生化分析仪进行分析检测。这种方法优点是准确,缺点是检测时间长、需要血液量多,需专业人员操作,不利于病人自我监护。为了解决这一问题,同时也为医院提供一种快速简便的检测辅助手段,作者开发出一种便携式血糖仪,测量时只需一片试纸、6μl的血(全血),就可在50s的时间内检测出血糖浓度。1生色原的选择目前比较流行酶法分析测定血液中葡萄糖的含量,其中用得最多的方法是葡萄糖氧化酶(GOD)—过氧化物酶(POD)比色法。其反应原理是利用在GOD氧化葡萄糖时产生的H2O2,在POD存在时把还原型生色原氧化成氧化型生色原,其产量与血糖浓度成正比。生色原很多,如邻联茴香胺、邻联甲苯胺、3-甲基苯噻唑啉酮腙联偶N,N-二甲基苯胺(简称MBTH-DMAB)、ABTs以及4-AA-酚等。综合考虑,选用MBTH-DMAB做为生色原。葡萄糖氧化酶(GOD)——过氧化物酶(POD)联偶分析法检测葡萄糖的反应式(1)如下:葡萄糖+O2+H2O−→−GODH2O2+O—葡萄糖酸(1)H2O2+DH2−→−POD2H2O+D(2)(氧化型生色原)(还原型生色原)葡萄糖+Ο2+Η2Ο→GΟDΗ2Ο2+Ο—葡萄糖酸(1)Η2Ο2+DΗ2→ΡΟD2Η2Ο+D(2)(氧化型生色原)(还原型生色原)在上述反应中,MBTH-DMAB在反应前为无色,反应后为兰色,在590nm附近光吸收强度变化灵敏。通过在此波长测量光的吸收强度,可计算出血液葡萄糖的浓度。2mbth-dmab法在医院中,化验人员需按专门的操作规程操作生化分析仪,将参与反应的酶或化学药品配制成溶液,将分离出的血清与配制好的溶液按比例混合,然后放入仪器检测。这种方法操作复杂,医生或病人无法亲自操作。将反应(1)、(2)中的两种酶通过固定化方法固定在尼龙66膜上,同时使生色原MBTH-DMAB吸附在同一膜上,使酶和染料在膜上均匀分布,并保持稳定。测量时,将约6μl的血样(全血)滴在尼龙66膜(已固定好酶和染料)的反应区,反应生成物的颜色会在膜反应区背面显现,用特定波长的光照射,反射光通过光电探测器接收。由于颜色的不同深度对光强的吸收不同,通过检测反射光强度,可以确定血糖浓度。2.1光辐射作用下t选用发光波长在590nm附近的发光器件作为光源,发光强度通过电路控制,当一定强度的光由膜反应区反射至探测器接受面时,其强度(辐射通量)为:W=(W1α1−W2)α2(3)W=(W1α1-W2)α2(3)其中:W1发光器件输出辐射通量W2反应区吸收的辐射通量α1到达反应区光辐射通量的比例α2反射回探测器光辐射通量的比例这时光电探测器在外电路中产生电流I为:I=Id−IΦ=Is(eqU/KT−1)−IΦ(4)Ι=Ιd-ΙΦ=Ιs(eqU/ΚΤ-1)-ΙΦ(4)其中:IS—探测器不受光照时的反向饱和电流IΦ—探测器光照下产生的光电流q—电子电荷U—外电路电压K—波尔兹曼常数T—器件工作环境的绝对温度如图1所示,电流经过电流电压转换、放大,再通过滤波器滤去干扰信号,然后送入单片机,通过程序计算,得出血糖的浓度值。2.2葡萄糖氧化酶、过氧化物酶的生物吸附和物理包埋为了使血糖检测仪操作简单,便于病人自我监测,选用固定化方法将酶以及生色原固定在特殊的载体上是必需的。根据WERNER以尼龙66为载体固定酶的原理,我们选用尼龙66做为载体,通过浸泡的方法将葡萄糖氧化酶、过氧化物酶以及MBTH-DMAB通过吸附及物理包埋原理固定在尼龙66上。固定时分两步,第一步固定染料,第二步固定酶。具体操作如下:(1)由于MBTH-DMAB中有一种不溶于水,所以将MBTH-DMAB溶解于水和乙晴混合溶液,加入表面活性剂Triton-100,溶解均匀,将尼龙膜片放入浸泡,取出干燥,待用。(2)将葡萄糖氧化酶、过氧化物酶以一定比例溶解于pH=6.5的柠檬酸钠缓冲液中,加入一定比例Triton-100和白蛋白,混合均匀,将浸泡过染料并干燥好的尼龙膜放入浸泡,取出烘干。将干燥后的膜剪成1厘米见方的小片即可使用。3结果和讨论3.1覆盖血糖及血糖等范围本仪器测定全血葡萄糖浓度时,线形范围为0.3～30mmol/L,覆盖正常人血糖范围3.7～6.1mmol/L以及低血糖、高血糖症范围。3.2回归方程取医院化验室血液样品90例,做无糖化处理,加入不同量的葡萄糖使样品浓度分布从0.3～30mmol/L,使用本仪器与大型生化分析仪同时测试,结果如图2,回归方程Y=1.0169X-3.275,相关系数R=0.9813。3.3初始梯度分辨率测量结果当检测高浓度血糖时,由于反应结果的颜色过深,吸收光强过大,导致反射到探测器的光强变弱,使测得的浓度梯度变得不明显,因此在高浓度时梯度分辨率变低。如图3所示。3.4讨论(1)酶测试经过实验证实,酶在固定化后,储存期和使用寿命变长,在常温下保存数月而性质改变很小;对葡萄糖具有好的专一性,测得的是β-D葡萄糖。(2)测试结果可靠本仪器采用光学传感器对生物信号进行检测,测试时间短(50s),需要样品量少(6μl),测试结果可靠,测试范围满足临床要求。适用于医院及家庭自我监控。(3)测量结果的偏移测试时环境的温度及空气的相对湿度对测量结果有影响。温度的影响主要表现在两个方面,一方面由于此方法采用速度法,在不同的温度条件下,酶系的反应速度不同,因此在所取时间点达到的反应程度不同,导致对于相同浓度的血糖,反应颜色不同,从而使测量结果发生偏移;另一方面,由于仪器的发光器件的发光强度随温度的升高而下降,而光电器件的输出随温度的升高而升高,如不加以校正,也会影响测量结果。