基于is序列的凤尾菇系统发育研究

基于is序列的凤尾菇系统发育研究

凤尾藻是一种常见的亚热带和亚热带林区野生菌。1973年在印度首次成功种植。20世纪80年代前后，张淑婷、刘仲柱和费孝通先后将印度凤尾藻引入香港和澳大利亚。由于它适应性和抗逆性强,成本低产量高,味道鲜美,营养丰富,很快便成为全国广泛栽培的食用菌。但其拉丁学名及分类地位一直以来都存在很大争议。在不少有关食用菌研究的文章或书籍中,常常将凤尾菇(P.sajor-caju)与平菇(Pleurotusspp.)归为侧耳属(Pleurotus),命其拉丁名为P.sajor-caju,偶见有将其归为韧伞属(Lentinus),认为其拉丁名为Lentinussajor-caju。佩格勒和姚一建通过传统的形态特征比较,认为凤尾菇应归为韧伞属而不是侧耳属,因为韧伞属和凤尾菇形成担子果的菌丝系统为双系菌丝型,而侧耳属形成担子果的菌丝系统为单系菌丝型。此外更有部分专家学者认为凤尾菇是肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)的俗称。而利用ITS序列分析方法针对凤尾菇的分类地位及拉丁名进行研究考证目前尚未见报道。核酸序列分析依托于物种的基因型,因而能更客观真实地反映遗传本质,且不同区段序列的保守性不同,适用性广,可根据需要选择相应的目标序列。本文首次运用ITS序列分析结合碱基比对,力求从客观的角度对我国目前栽培的凤尾菇分类地位进行进一步研究,为凤尾菇及其近缘种的分类提供理论基础。1材料和方法1.1.日本微生物大学所有供试菌种见表1,其中凤尾菇(GIM5.82)由广东省微生物研究所菌种保藏中心朱红惠研究员赠送,引自香港中文大学;其它实验菌种由广东省微生物研究所食用菌研究发展中心提供。1.2菌种活化剂CPDA:马铃薯200g,葡萄糖20g,MgSO4·7H2O3g,KH2PO41.5g,琼脂20g,纯水1000mL。用于活化菌种。CYM:葡萄糖20.2g,蛋白胨2g,酵母膏2g,K2HPO41g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O0.5g,纯水1000mL。用于扩增菌丝。各菌种在CPDA斜面25℃活化,待斜面长满,将菌种转接入含300mLCYM的500mL三角瓶中,每支试管种约可以转接6瓶液体种,25℃130r/min摇床培养6～8d,菌丝经真空抽滤,无菌水洗涤,低温干燥,-20℃保存备用。1.3yolamwellum内部法参照EDWARDS等的CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)法并略作修改,菌丝经液氮研磨、CTAB提取、氯仿/异戊醇(24∶1)除蛋白、异丙醇沉淀DNA、酒精洗涤、最后用TE缓冲液溶解DNA。1.4pcr扩增及测序采用真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1和ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增。引物由Sangon公司合成,扩增在BiometraT3000PCR仪上进行。反应体系:2×PCRTaqmix(东盛生物科技有限公司)25μL,DNA模板5μL,ddH2O12μL,引物(10umol/L)4μL×2,总体积50μL。反应条件:94℃5min;94℃1min→55℃1min→72℃1min,30个循环;72℃10min。1.5pcr扩增产物的纯化PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,在UVP凝胶成像系统下成像保存。PCR扩增产物回收纯化后,以PCR引物为测序引物,分别从正反链双向测序,由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。双向序列用BioEdit软件拼接后提交至GenBank。1.6系统发育树的构建测得序列在GenBank上Blast,对获得的同源序列进行分析。通过BioEdit对构树序列进行编辑,用ClustalX进行多重比对,最后用MEGAVersion3.1构建系统发育树:按照NJ(neighbor-joining)法,基于Kimura双参数模型,以蛹虫草(Cordycepsmilitaris)和冬虫夏草(C.sinensis)为外类群(outgroup),经bootstrap(1000次循环)检验系统树可靠性。1.7碱性饱和度比对照利用BioEdit软件截取近缘序列的ITS1-5.8S-ITS2区段,再用Clustalx软件进行完全比对。2结果与分析2.1侧耳属种的选择从图1系统发育树可以看到,实验菌株GIM5.82位于侧耳属的分支上,它与侧耳属内各种的相似性均达98.5%以上,可信度为100%;韧伞属和香菇属内种相似性也都为98%,可信度为100%;但侧耳属与韧伞属、香菇属的相似性仅约为80%,因此凤尾菇应归为侧耳属,隶属于担子菌门(Basidiomycota)层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)侧耳科(Pleurotaceae)。系统发育树还表明:凤尾菇GIM5.82与其它从GenBank上下载的3个凤尾菇(P.sajor-caju)、2个肺形侧耳(P.pulmonarius)以及实验菌种P-18(P.pulmonarius)、P-24(P.pulmonarius)在侧耳属的一个小分支上聚在一起,相似性为100%,可信度为95%。2.2u3000yngiii-sas-整合型碱基的比对为研究菌株之间的关系,笔者做了进一步的分析,截取各序列的ITS1-5.8S-ITS2区段做碱基比对分析。对4个凤尾菇(P.sajor-caju)、3个肺形侧耳(P.pulmonarius)、2个糙皮侧耳(P.ostreatus)以及1个刺芹侧耳(P.eryngii,杏鲍菇)的ITS1-5.8S-ITS2区段碱基进行完全比对。结果表明:凤尾菇GIM5.82与实验菌种P-18、P-24以及从GenBank上下载的来源于不同国家的3个凤尾菇、1个肺形侧耳的ITS1-5.8S-ITS2区段碱基完全一致,且长度均为580bp;而与2个糙皮侧耳、杏鲍菇分别存在着19处和28处碱基差异,2个糙皮侧耳间仅有一个碱基差异,长度均为589bp,杏鲍菇的碱基长度为588bp。由此,笔者认为凤尾菇与肺形侧耳应为同物异名种。此外,碱基比对结果还表明,5.8S序列将ITS序列分隔为ITS1和ITS2两个区段,序列的碱基差异多数出现在ITS2区段,少数出现在ITS1区段,而5.8S区段的碱基则完全一致,可见ITS2的进化速度较ITS1快,而5.8S则较为保守。因此在其它类似研究中,我们可以根据研究的需要选择rDNA上进化速度不同的目标区段进行分析。3与肺形侧耳、凤尾菇的系别关系本文运用ITS序列分析对我国目前栽培的凤尾菇及其近缘种的亲缘关系进行研究,构建系统发育树。系统发育树的结果表明,凤尾菇应隶属于侧耳属。为进一步探索确证凤尾菇及其近缘种的关系,本实验对包括凤尾菇、肺形侧耳等在内的10个侧耳属菌株的ITS1-5.8S-ITS2区段进行碱基完全比对,结果发现4个来源于世界各国的凤尾菇与3个同样来自不同国家的肺形侧耳的碱基完全相同,而它们与侧耳属其它种却存在较大差异,同样,其它侧耳属不同种间的碱基也存在很大差异。因此,我们认为我国目前广泛栽培的凤尾菇乃至世界其它国家被命名为“Pleurotussajor-caju”的菌种与肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)可能为同物异名。这与GONZALEZ和LABARèRE以及马富英和罗信昌的研究结论一致:GONZALEZ和LABARèRE通过对线粒体小亚基rDNA可变区V4、V6、V9进行研究认为,肺形侧耳与凤尾菇是同一个种的两个不同名称;马富英和罗信昌运用28SrDNA-RFLP分析也证实了这一点。ZERVAKIS对源自东南亚的野生分离株P.sajor-caju进行交配实验研究,结果显示,P.pulmonarius和P.sajor-caju单核体杂交产生较高亲和性(约50%～100%),形态学及生理学对比实验也显示出二者有广泛的相似性。此外,同工酶及rDNA多态性研究也表明两者具有很高相似性,因此他们认为P.sajor-caju是P.pulmonarius里的一组菌株。但是据PEGLER描述,P.sajor-caju具有菌环,有多系菌丝系统,几乎没有子实层基,故该类群应为韧伞属(Lentinus),且HILBER也赞同该观点。两种截然不同的结论的产生是因为由RANGASWAMI于1975年提交的ATCC32078一直被当成P.sajor-caju的模式标本,它在ATCC目录里的属名也一直在Pleurotus和Lentinus之间改来改去,但后来研究发现它与欧洲的P.pulmonarius株完全亲和。因此ZERVAKIS认为对Lentinus物种的特征表述(比如有菌环,不同菌丝系统、担孢子大小等)是正确的,但它不是用来描述P.sajor-caju。而现行栽培凤尾菇菌种P.sajor-caju和L.sajor-caju根本不相关,二者是异源的。另有研究者认为目前栽培的凤尾菇实际包含两个种,一种能产生菌丝素,和泡囊侧耳(P.cystidiosus)同组;另一种与肺形侧耳(P.pulmonarius)杂交可孕,该种分离自多山地带,子实体与肺形侧耳极为相似。也就是说,L.sajor-ca