应用大规模并行基因组测序技术检测孕妇外周血浆中的游离dna

应用大规模并行基因组测序技术检测孕妇外周血浆中的游离dna

胎儿染色体非整体疾病包括21-三体综合征（唐综合征）、18-三体综合征（德华综合征）、13-三体综合征（帕特综合征）等。唐氏综合征又称先天愚型或21-三体综合征,是新生儿常见的染色体病,发生率约为1/800,占小儿三体型染色体病的70%~80%,发生率随着母亲年龄的增高而上升。传统的产前诊断方法是通过获取胎儿的绒毛、羊水、脐血或者胎儿的组织来进行诊断,这些侵袭性的产前诊断技术对胎儿和孕妇有一定的风险,可以导致宫内感染、流产等不良后果,难以被广大孕妇和家庭所接受,所以无创产前诊断成为一个长期追求目标。1997年Lo等研究报道了孕妇的血液循环中有cff-DNA的存在,后来有研究也报道发现孕妇血浆中存在胎儿核糖核酸(RNA),这些重大发现为无创性产前诊断提供了新的可能。近年来无创性产前诊断也取得了巨大的发展,胎儿游离细胞已经成功地应用于非侵入性产前诊断胎儿性别和Rh血型鉴定,这些研究的基础都是对母体血浆中胎儿特定DNA序列的测定。但是在孕妇外周血中母源性游离DNA占绝对优势,胎儿游离DNA只占孕妇血浆总DNA约3%~5%,所以传统的DNA提取技术及PCR等方法难以对胎儿唐氏综合征进行准确的判断。本研究成功地解决了21-三体、18-三体胎儿母体外周血中DNA小增量的问题,这种方法可以快速、简便、安全地诊断胎儿染色体非整倍体,具有较高的临床应用价值。1材料和方法1.1唐氏综合征筛查风险情况选择2009年1月至2010年7月在深圳市人民医院产前诊断中心就诊,高龄妊娠、唐氏综合征生化筛查高风险和(或)彩超显示胎儿异常等同意介入产前诊断的孕妇941例,孕龄为8~30周,平均(20.7±3.2)周,孕妇年龄21~45岁,平均(30.8±5.5)岁。获得每个参与者的知情同意后抽取外周静脉血5mL。1.2实验方法1.2.1血清学离心在孕妇进行羊水穿刺或脐血穿刺前抽取受试者外周静脉血5mL,EDTA抗凝,在4℃下1600g离心10min,取上清悬浮液分装到无菌离心管中,初步分离的血浆在4℃下再次离心,16000g离心10min,以去除残留的细胞。这2次离心步骤是在采血后的4h内进行。血浆存放-80℃冰箱进一步冻存,而且只能在DNA提取前解冻1次。1.2.2dna的提取使用TIANampMicrokit试剂盒(天根生化科技有限公司)从样本血浆中提取DNA,严格按照说明书操作。提取过程中应设置阴性对照和重复对照。提取后的DNA在-80℃条件下保存。1.2.3pcr产物的纯化及测序提取的血浆DNA,应用T4DNA聚合酶(T4DNAPolymerase)、克列诺片段(KlenowFragment)和T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)对片段末端进行修复。在3′端加碱基“A”使得DNA片段与5′端带有“T”碱基的特殊接头连接。通过PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段并对PCR产物进行纯化。使用Agilent2100Bioanalyzer检测文库大小及产量,并使用Q-PCR检测文库产量。定量好的文库通过与flowcell上的接头进行杂交,在Illuminaclusterstation通过桥式PCR进行扩增长成cluster,cluster长好后在IlluminaGenomeAnalyzer上进行测序。1.3新生儿患唐氏综合征、18-三体的覆盖深度本研究使用IlluminaHiSeq2000高通量测序仪检测,将孕妇血中所有游离DNA,不论其来源全部进行测序,获得分布在每条染色体上的真实的核酸片段数量,根据生物信息学分析,计算出每条染色体对应的覆盖深度值,并转化为衡量风险的风险指数,确定胎儿患唐氏综合征、18-三体的风险率。测试样本中染色体NDNA所占总DNA比例可以表示为:覆盖深度Cov-chrN。通过华大基因自主研发的GC关联T检验方法检测测试样本中覆盖深度CovchrN与标准参照样的覆盖深度Cov-chrN是否有显著性差异来判断胎儿是否为唐氏综合征或18-三体综合征,统计检验的值为T值,T值的计算:与孕整倍体胎儿母体血浆中chr21或chr18的关联T均值和标准差相比较,孕21-三体胎儿的孕妇血浆中chr21的T值较高,孕18-三体胎儿的孕妇血浆中chr18的T值增高。1.4诊断方法1.4.1基因组的制备及测序由深圳华大基因研究院、深圳华大临床检验中心进行DNA提取、文库制备以及并行基因组测序。测试样本的chr21的T值≥3即判定胎儿为唐氏综合征高风险,测试样本的chr18的T值≥3即判定胎儿为18-三体综合征高风险。1.4.2胎儿染色体的核型诊断方法941例孕妇均采集羊水或者脐血,由深圳市人民医院临床医学研究中心细胞遗传室经细胞培养,进行G显带染色体核型分析。2结果2.1唐氏综合征风险程度t值结果见图1。941例样本根据实验方法处理进行测序后,计算T值范围是-3.8300~11.7297,平均T值为(0.0080±1.6231)。其中27例样本chr21的T值≥3判定胎儿为唐氏综合征高风险,914例样本chr21T值<3判定胎儿为非唐氏综合征;14例chr18的T值≥3,判定胎儿为18-三体综合征高风险,927例样本chr18的T值<3判定胎儿为非18-三体综合征。2.2唐氏综合征非唐氏综合征941例孕妇羊水或者脐带血染色体核型分析,其中唐氏综合征25例,非唐氏综合征916例;18-三体综合征15例,非18-三体综合征926例。2.3大规模联合重组的结果与染色体核分析的结果进行了比较2.3.1置信区间25例唐氏综合征高风险的样本T值范围为3.3927~11.7927,平均T值为(6.8717±2.3776),95%置信区间为(6.1813,7.5621);916例非唐氏综合征的孕妇T值范围为-3.8300~8.2814,平均T值为(-0.1814±1.1111),95%置信区间为(-0.2543,-0.1086),唐氏综合征高风险T值和非唐氏综合征95%置信区间T值无重叠。进行两样本均数比较t检验(t=-29.69,P<0.01),两组总体均数的差别有统计学意义。2.3.2无创产前基因检测结果由表1可见,大规模并行基因组测序结果和染色体核型分析结果比较,唐氏综合征胎儿的检出率为100%(25/25),漏诊率为0,误诊率为0.22%(2/941),阳性预测值92.59%(25/27),阴性预测值100%(914/914)。941例样本中,检出18-三体高风险14例,18-三体低风险927例。通过公式计算,与临床金标准方法——染色体核型分析相比(941例样本中有15例为18-三体综合征),统计分析显示无创产前基因检测18-三体胎儿的检出率为93.33%(14/15),漏诊率为6.67%(1/15)、误诊率为0。阳性预测值100%(14/14),阴性预测值99.89%(926/927)。2.4不同体胎儿检出率结果见表3。941例孕妇样本中最小孕周为8周,最大孕周为30周,结果分析提示21-三体胎儿检出率为100%。表3中10例孕妇分别在不同孕周抽取外周静脉血行大规模并行基因组检测,经配对t检验,得出t=-0.96,P=0.362,结果显示同一孕妇不同孕周的两次T值差异无统计学意义。3讨论3.1分离后,胎儿游离dna的变化1997年Lo等在孕妇外周血中发现胎儿细胞和胎儿DNA的存在,为无创性产前诊断开辟了新的途径。孕妇外周血中的游离胎儿DNA之所以可以运用于无创性产前诊断,是因为他们具备以下的几个特点:孕妇血中胎儿游离DNA极为丰富,是孕妇血中胎儿细胞的970倍,母体外周血中游离胎儿DNA保留了父母的多态性位点信息,且生产以后会被迅速清除,平均半衰期为16.3min,大部分孕妇产后2h即检测不到胎儿游离DNA的存在,使得本次妊娠的胎儿游离DNA水平不会受上次妊娠的影响。最近的研究发现了母体血浆中胎儿DNA和母体DNA之间的本质差异,胎儿DNA分子一般短于母体DNA分子,并且有不同的甲基化模式,根据上述胎儿游离DNA的特点,研究者们一直致力于母体血浆中胎儿游离DNA在无创产前诊断中的应用,主要的方法基于多态位点差异的单点PCR、甲基化特异PCR、数字PCR等,目前这些技术已经成功应用于胎儿性别及性连锁疾病、RHD血型等疾病的检测,但是这些技术大多数都是依赖于单核苷酸多态性,因此只能对于少数人群进行检测,不能广泛应用于临床检测。3.2抗混血染性基因检测本研究采取大规模并行基因组测序法,其基本的理论依据为:以唐氏综合征为例说明,孕妇外周血中存在胎儿游离DNA,孕21-三体胎儿的孕妇外周血中的21号染色体的游离DNA比例比孕正常胎儿孕妇的高。本研究检测方法是将孕妇外周血浆中的所有的DNA片段,不论其来源全部进行高通量测序,并对测序结果进行生物信息分析,计算出胎儿患唐氏综合征的风险率(chr21T值≥3,判定胎儿为唐氏综合征)。2008年Fan等利用鸟枪法测序技术成功检测出12例三体综合征胎儿,其中包括9例21-三体,2例18-三体和1例13-三体。2008年Chiu等利用大规模并行基因测序技术检测了28例孕妇外周血标本,其中14例唐氏综合征胎儿和14例正常胎儿均被准确检测。2010年Lo等研究表明对母亲外周血中的胎儿游离DNA进行全基因测序是诊断胎儿染色体疾病的一种非侵入性的诊断。2011年Lun等报道运用大规模并行基因组测序法成功检测出1例易位型21-三体。2011年Chiu等应用大规模并行基因组测序技术检测753例唐氏筛查高风险的孕妇外周血,其中86例胎儿为唐氏综合征高风险,与染色体核型进行比较分析,发现唐氏综合征胎儿的检出率为100%。本研究对941例孕妇外周血进行大规模并行基因组测序检测,检出27例胎儿唐氏综合征高风险,914例胎儿唐氏综合征低风险,唐氏综合症胎儿的检出率为100%,漏诊率为0,误诊率为0.22%(2/941)。大规模并行基因组测序技术不仅可以用于胎儿21-三体的检出,同样也适用于其他染色体非整倍体的检出,如:18-三体、13-三体以及性染色体的异常等。2011年Chen等应用此方法对329例孕妇外周血DNA进行基因测序,检测出25例13-三体和34例18-三体,最后得出13-三体和18-三体的检出率分别是100%和91.9%。本研究941例样本中,检出18-三体高风险病例14例,18-三体低风险病例927例。与临床金标准方法———染色体核型分析法相比(941例样本中有15例为18-三体综合征),统计分析显示无创产前基因检测18-三体的检出率为93.33%、漏诊率为6.67%、误诊率为0。本实验中误诊的2例唐氏综合征病例和漏诊的1例18-三体综合征均在实验初期出现,通过不断改进生物信息学分析方法,提高了检测精度,使临床实验阶段的高通量基因测序结果更为准确。2例非唐氏综合征样本误诊为21-三体,其中1例染色体核型为47,XYY,1例染色体核型分析正常;1例18-三体综合征漏诊。经分析发现除各种情况下引起的标本污染或者方法不当可以引起误诊外,母体血浆中胎儿DNA的量也是一个影响因素。母体血浆中胎儿DNA的量可能和胎盘的屏障有很大的关系,胎儿游离DNA主要来源于胎盘组织,少量来源于胎儿与母体的交换,如果胎盘屏障致使母体血浆中的胎儿DNA的量受到影响,如胎盘钙化、胎盘发育不良、胎盘破损等,对检测结果会产生影响,因此尚需继续观察并注意个体差异。另外一个原因可能由于XYY的Y染色体上有一小段21号染色体的易位,可引起测序结果出现假阳性。2011年Papageorgiou等提出利用胎儿特异甲基化DNA比例无创性产前诊断唐氏综合征,检测孕妇外周血中孕正常胎儿和孕21-三体胎儿的差异甲基化区域DNA含量的比例,然后进一步进行数据统计分析,这种方法解决了本研究的局限性。通用的产前筛查方法是检测与染色体非整倍体异常相关的因素,而不是直接检测胎儿的实际染色体剂量,所以目前的唐氏综合征筛查方案有5%的假阳性率,这些高风险的孕妇需要进行进一步侵入性产前诊断。如果将大规模并行基因组测序应用于临床筛查,因其具有高度准确性,仅有1%的高危孕妇需要进行侵入性产前诊断,将大大地降低进行侵入性产前诊断的孕妇数量,降低孕妇的心理压力。利用大规模并行基因组测序方法可以重新建立新的胎儿染色体非整倍体的产前筛查和无创产前诊断模式:(1)对于高龄妊娠、唐氏综合征生化免疫筛查高风险等有产前诊断指征而又高度恐惧介入产前诊断手术的孕妇,可建议其在12~22周行大规模并行基因组测序检测,若检测结果为染色体非整倍体高风险,就必须再次书面建议孕妇行介入产前诊断;(2)在严格掌握适应证的前提下,孕妇可直接选择大规模并行基因组测序检测胎儿染色体非整倍体风险,对于染色体非整倍体高风险孕妇须书面建议介入产前诊断。本研究中,有1例孕妇唐氏综合征筛查2次均为高风险,孕妇及家属拒绝进行介入性产前诊断,经过孕妇及家属知情同意选择做了本实验。根据大规模并行基因组测序技术结果诊断胎儿为唐氏综合征高风险,遂再次动员孕妇进行介入产前诊断,经脐血细胞染色体核型证实胎儿为21-三体,予以选择性流产