山楂叶总黄酮的体外清除活性研究

山楂叶总黄酮的体外清除活性研究

自由基包含一个或多个未成对的电子的原子、分子或离子。自由基很活泼,具有高度的化学反应活性,自由基过多或清除过慢,会加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。经研究发现,自由基与一百多种人类疾病有关。而黄酮类化合物通过酚羟基可与自由基反应,生成比较稳定的半醌式自由基,从而终止了自由基链式反应,其清除自由基的能力与其结构特别是芳香环核失电子有关。近年来,对一些黄酮类物质清除自由基性能的相关研究发现,不同的黄酮类化合物对自由基的清除活性有一定差异。黄酮类化合物种类较多,种类之间结构也有一定差异,因此不同的黄酮类化合物其生物活性也有所不同。山楂叶中富含黄酮类化合物,含量高达1.8%~2.0%。山楂叶黄酮在治疗冠心病、心绞痛、心肌炎及高血脂病等方面有一定的效果,但有关其清除自由基活性的研究报道还很少。本文以毛山楂树秋天的落叶为原料,提取其中的总黄酮,并以VC和芦丁为对照品,采用DPPH(二苯代苦味酰肼自由基)体系和超氧阴离子自由基体系对山楂叶总黄酮的体外抗氧化性进行了研究,为山楂叶资源的进一步高效利用提供一定的理论依据。1材料和方法1.1自由基和二次蒸馏试验用原料为采自东北林业大学校园的毛山楂(CrataegusmaximowicziiSchneid.)秋天落叶,阴干。试剂有芦丁标准品和DPPH自由基,均为美国Sigma公司生产;无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、浓盐酸、三羟甲基氨基甲烷、VC、邻苯三酚,均为分析纯;二次蒸馏水为市售。主要试验仪器有RE-52旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂)、SHB-95A循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)、TU-1900紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、PHS-3C酸度计(上海雷磁创益仪器仪表有限公司)。1.2测试方法1.2.1料液比的确定粒度为0.21~0.55mm的山楂叶粉,料液比1∶10(g∶mL),用70%乙醇80℃水浴回流提取3次,每次1h;合并滤液,减压浓缩至无醇味,蒸干,得山楂叶总黄酮。1.2.2dpph自由基清除率测定配制山楂叶总黄酮、芦丁、VC3种待测液,质量浓度分别为2、2、0.4mg/mL。称取10.3mgDPPH自由基,用无水乙醇定容至250mL,溶液浓度为0.1mmol/L,将其盛于棕色容量瓶中,置于暗处保存。分别取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL各待测液,加入2mLDPPH自由基溶液,用无水乙醇将体系均补至4mL,摇匀,10min后以无水乙醇作为参比,测定不同时间各体系在517nm波长处的吸光度;将样品用等体积水代替,即体系中仅含DPPH和无水乙醇,其他同前,测定吸光度。另将DPPH自由基溶液用等体积水代替,即体系中仅含样品和无水乙醇,其他同前,测定吸光度。DPPH自由基的清除率计算公式K=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%式中,K为清除率;Ai为加试样反应后DPPH溶液的吸光度;Aj为不加DPPH,只加试样溶液的吸光度;Ac为不加试样,只加DPPH溶液的吸光度。1.2.3反应速率的测定采用邻苯三酚自氧化法。在25℃恒温条件下,在10mL容量瓶中加入pH值为8.30的0.05mol/LTris-HCl溶液5.0mL、2mmol/L的邻苯三酚0.2mL,加待测液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL(不加待测液为对照),然后再加一定量缓冲溶液至体系总体积9mL,并以二次蒸馏水做参比,邻苯三酚最后加入,迅速混匀后用紫外可见分光光度计测定322nm波长处的吸光度,每隔1min测一次,直到反应启动后第9min;把所得的数据以时间为横坐标、A322值为纵坐标进行线性回归,得到的直线斜率为反应速率V空、V样。清除率按下式进行计算K(%)=(V空-V样)/V空×100式中,V空为不加待测液时的反应速率;V样为加入待测液时的反应速率。2结果与讨论2.1不同加入量对dpph自由基的清除能力的影响DPPH(2,2-diphenyl-1-picry-hydrazylradical)是一种较为稳定的自由基,分子结构中有未成对电子,其乙醇溶液呈蓝紫色,在517nm处有最大吸收值。当未成对电子被其它自由基电子配对后,吸收值降低,其褪色程度与其所接受的电子数呈定量关系。当与抗自由基活性物质作用时,其吸收值降低越多,则表明抗自由基活性物质的活性越强,具体可由清除率来衡量。图1为不同加入量的山楂叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力。在反应体系中,加入量为0.4~2mg时,随着加入量的增加,山楂叶总黄酮对DPPH自由基的清除率逐渐增加;加入量不变,清除率随时间的延长先迅速增加而后趋于平缓。在加入20min时,各加入量对DPPH自由基的清除率均接近最大值。加入量达到2mg时,清除率最大,可达50.29%。可见,山楂叶总黄酮对DPPH自由基有一定的清除能力。图2为不同加入量的芦丁对DPPH自由基的清除能力。在反应体系中,加入量在0.4~2mg时,芦丁对DPPH自由基的清除率随加入量及时间的变化趋势类似于山楂叶总黄酮。加入量2mg时,清除率最高可达63.83%,而且相同加入量时,芦丁的清除率曲线上相应的值要高于山楂叶总黄酮,说明芦丁对DPPH自由基的清除能力强于山楂叶总黄酮。图3为不同加入量的VC对DPPH自由基的清除能力。在反应体系中,加入量在0.08~0.4mg范围内时,VC对DPPH自由基的清除率随加入量及时间的变化趋势类似于山楂叶总黄酮和芦丁。在加入10min时,各加入量对DPPH自由基的清除率均接近最大值。加入量为0.4mg时,清除率最大可达69.93%,可见VC对DPPH自由基的清除能力远大于芦丁和山楂叶总黄酮。同时,综合比较图1~图3发现,VC对DPPH自由基的清除速度较快,而山楂叶总黄酮对DPPH自由基的清除速度与芦丁相当,比VC要慢些。2.2不同物质对超氧阴离子自由基的清除率在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,生成超氧自由基和有色中间产物,该有色产物有特征吸收峰。当加入自由基清除剂时,超氧自由基的生成受到抑制,邻苯三酚自氧化过程受阻,特征吸收峰减弱,具体由清除率表示清除作用的相对大小。表1为各物质不同加入量时的反应速率,根据清除率公式,计算出各物质对超氧阴离子自由基的清除率。图4为不同物质对超氧阴离子自由基的清除效果,其中VC对超氧阴离子自由基具有较强的清除作用,随着其加入量由0.08mg增加至0.32mg时,清除率由34.91%迅速升高至98.58%;加入量为0.4mg时,清除率已接近100%。同样,芦丁对超氧阴离子的清除率也随加入量的增加而升高,但升高的幅度与VC比却小得多,芦丁加入量为2mg时,清除率达到32.55%。山楂叶总黄酮加入量在0.4~1.2mg范围时,清除率随加入量的增加而增加,加入量为1.2mg时,清除率达到最高为27.36%,此时比芦丁的清除率高。但山楂叶总黄酮加入量超过1.2mg时,清除率却有所下降,明显低于芦丁。而二者最高清除率也仅接近于0.08mgVC的清除率,足见二者对超氧阴离子自由基的清除能力较VC低很多。3清除超氧阴离子自由基的能力3.1加入量在0.4~2mg范围时,山楂叶总黄酮对DPPH自由基和超氧阴离子自由基均具有一定的清除作用。山楂叶总黄酮加入量为2mg时,对DPPH自由基的清除率达到最高值50.29%;当加入量为1.2mg时,对超氧阴离子自由基的清除率达到最高值27.36%。山楂叶总黄酮对DPPH自由基的清除作用强于对超氧阴离子自由基的作用。3.2芦丁的加入量为2mg时,对DP