内皮抑素的测定及其生物活性研究

内皮抑素的测定及其生物活性研究

肿瘤的生长与血管生成依赖。原发肿瘤的生长、浸润和转移均需要新生血管,因而,肿瘤的抗血管生成治疗是近年来肿瘤治疗研究中的一个热点。1997年,O′Reilly等在鼠内皮瘤细胞培养液中发现了一种新的、分子量为20kD的蛋白质。体外实验表明它能特异性地抑制内皮细胞增生,并呈剂量依赖性,这一新的血管抑制因子被命名为内皮抑素(Endostatin,ES)。ES优良的生物活性,使之在肿瘤抗血管生成治疗中展示了诱人的前景。本研究试图建立131I标记ES的方法,为ES的临床应用研究提供新的思路。1材料和方法1.1人瑶静脉内皮细胞系ES购自Sigma公司,131I由北京原子高科公司提供;Iodogen为Pierce公司产品。人脐静脉内皮细胞系(ECV304)购于上海细胞生物学研究所;MTT(四唑盐)购自北京鼎国生物公司。1.2实验方法1.2.1iofigen薄膜的制备①涂管:称取0.5mgIodogen溶于0.25ml二氯甲烷内,分别取上述溶液30μl(约含50μgIodogen)分装在各反应试管内,室温自然干燥,使管底形成一层Iodogen薄膜,-20℃避光保存;②碘化标记:含有Iodogen膜的反应管内,加入0.3M磷酸盐缓冲液,加入待标记ES样品,再加入无载体131I,混匀,在室温反应,并振荡数次。加入pH7.4的0.3M磷酸盐缓冲液终止反应,立即上柱纯化;③Sephadex-G25柱凝胶过滤法分离纯化:将全部反应液滴加于G25柱上,然后用同上磷酸盐缓冲液淋洗(pH7.4),流速0.5ml/min,每分钟收集1管,共20管,编号,测各管每分钟计数(countsperminute,cpm),绘制洗脱曲线、计算标记率。1.2.2正交实验结果将反应时间、ES用量、磷酸缓冲液用量、131I用量作为4个因素,对每个因素取3个水平进行正交实验,选取L9(34)正交表,依次进行实验,筛选出最佳标记条件。1.2.3展开剂为0纸层析法,支持体为新华Ⅰ号滤纸,展开剂为氯仿∶甲醇=7∶3,Rf值:131I-ES=0～3,游离131I=8～10,当展开剂到10cm时,晾干,用TLC-MINI-Scan进行扫描,Laura3.0软件系统进行分析。1.2.4外部稳定性试验体外室温放置后观察产物的稳定性。1.2.5tt法检测细胞a值人脐静脉内皮细胞系(ECV304)经培养至对数生长期,以5×103/孔将细胞接种于96孔培养板。37℃培养4h,以不同剂量的ES、131I及131I-ES处理细胞,并以同体积0.3mol/L磷酸缓冲液设为对照。继续培养72h后,每孔加100μgMTT,孵育4h,弃上清,加150μl二甲基亚砜,振荡10min,用酶联免疫检测仪检测450nm波长时的A值。处理组与对照组比较求得细胞存活率。2结果2.1标记的基础结构用正交实验进行筛选,共进行9次实验,分别用纸层析法测得标记率,得到最佳标记条件的线索。选取标记率最高者与未标记ES分别进行柱层析,两者A280(蛋白)分布图与131I-ES放射性分布图基本一致,说明核素成功地标记在ES上(图1、2)。对标记条件进一步摸索,得到最佳标记条件为ES20μg,Iodogen50μg,131I18.5MBq,反应时间1min,标记率可达(65.0±5.5)%。2.2外部稳定性室温静置5天后放化纯下降了11%;图3为不同时间后131I-ES中131I的解离曲线。2.3生物活性ES标记后,其抑制内皮细胞增生的生物活性明显强于单用ES或131I(图4)。3es的阳性超微结构标记ES是1997年由O′Reilly等在鼠内皮瘤细胞(一种非转移性小鼠肝血管瘤细胞系EOMA)培养液中发现的一种新的分子量为20kD蛋白质。体外实验表明它能特异性地抑制内皮细胞增生,并呈剂量依赖性,这一新的血管抑制因子被命名为内皮抑素。内皮抑素是胶原XVIIIC末端的一个分子量为20kD的片段,是一种内源性肿瘤血管生成和内皮细胞生长的抑制剂。这种胶原存在于细胞壁和基底膜上,在蛋白酶(如组织蛋白酶、基质金属蛋白酶)的作用下,它的蛋白C末端在酶作用下发生裂解而形成。ES抗血管生成的机制尚不清楚,但已有文献报导,ES可与血管内皮细胞上的硫酸粘蛋白类受体或血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的酪氨酸受体或整合素α2β1等竞争性结合,从而达到抑制新生血管的作用,这表明ES在血管内皮细胞膜上可能存在特定的结合位点。由于实体瘤血管内皮系统异常丰富,这形成了肿瘤阳性显像的基础。作者曾对血管抑素(Angiostitin)进行了99mTc的标记研究,发现在注药后6h可得到肿瘤清晰显像。ES是继血管抑素后发现的又一内源性血管生成抑制剂,本研究探索用131I标记ES,可为进一步研究ES在肿瘤显像和治疗方面的应用提供有力的工具。131I一直是内放射治疗的经典放射性核素,以其合适的射线能量、半衰期,而且可同时进行显像,几十年应用不衰,而且不断用于研制新的药物,如标记一些单克隆抗体等,在生物导向治疗中发挥作用。美国芝加哥大学的Hanna等人研究发现,荷瘤小鼠体内应用ES与外放射治疗相结合,其疗效明显优于单用ES或外放射治疗。因此,作者设想用131I标记ES,一方面,ES通过抗血管生成作用达到对肿瘤的抑制,同时ES对肿瘤的相对趋向性可使131I定位于肿瘤而对肿瘤细胞直接产生杀伤作用,从而对肿瘤产生双效治疗作用。ES属小分子量蛋白(20kD),其结构中含有131I标记时所必需的酪氨酸残基。根据此结构特性,作者用传统的Iodogen法对其进行标记。Iodogen法由于是固相氧化,反应体系中无过量氧化剂存在,