家禽用饲料品质检验-有毒有害成分的测定

项目三：家禽用饲料品质检验反相HPLC方法开发方法建立的一般步骤了解基本情况明确分离目的选择分离模式前期准备检索文献方法具体试验短柱长、高流速、标准品、高强度洗脱液参照文献方法调节k’值改变保留值调节α值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度方法建立的一般步骤调节k’值改变保留值调节α值改变选择性改变流动相中有机相比例60/4050/5040/60通过改变流动相组成改变选择性方法建立的一般步骤调节α值改变选择性通过改变固定相改变选择性C-18C-81、分析时要了解的情况想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献和方法仪器制造商的文献掌握分离机理，自己开发方法充分了解自己的样品样品所含化合物的数目、种类（官能团）、分子量、pKa值、UV光谱图以及样品基体的性质（溶剂、填充物等）、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。1、分析时要了解的情况灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂?是否已知样品所有成分的化学特性？有多少组分要分析?是否有必要解析出样品的所有成分？对分析的精确度、准确度等有多高要求?定量分析？定性分析？是否因是日常检验，而要求方法容易使用?本法将适用几种样品分析还是许多种样品分析？一次分析多少样品？2、确定样品的预处理方式可直接进样的溶液需稀释、pH缓冲、加入内标物或其它定容操作的溶液：多用流动相进行稀释定容需要首先溶解或提取处理的固体样品需预处理除去干扰物或消除“柱杀手”3、分离模式的选择4、具体试验的一般步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k’值改变保留值调节α值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度记住∶

每次改变一个参数5、使用文献方法的注意点色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）6、反相HPLC方案的设计步骤1、确定样品是属于常规的还是特殊的

特殊样品包括：无机离子对映体生物分子合成的高分子碳水化合物异构体6、反相HPLC方案的设计步骤2、选择分离条件，进行第一次分离分离变量最佳的初始选择柱填料C8

或C18柱结构15*0.46mm

或25*0.46mm，5μm流速1.5-2.0mL/min（注意柱压限制）流动相乙腈—水（中性样品）乙腈—缓冲液（离子型样品）（缓冲液为25-50mM磷酸缓冲液，pH2—3）对初始试验：5→100%B梯度温度常温进样量体积＜50μL（20μL）；质量<100μg反相HPLC首次分离的建议实验条件6、反相HPLC方案的设计选择流动相在反相色谱中常用水/乙腈pH的选择思路

选低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性低pH与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，组分在此条件下的tR受pH变化影响小

初期应避免使用三乙胺和离子对试剂等添加剂选择逐步方法开发步骤用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度

梯度尝试运行6、反相HPLC方案的设计第一次HPLC运行

准备标准样品

过滤样品

安装色谱柱

冲洗柱，平衡

平衡检测器

进样

分析结果第一次HPLC运行得到的结果可能是：

无峰/响应

分离度差的峰

检测方法不正确

浓度太稀提高进样浓度，或者在无色谱柱的条件下注射少量样品改变流动相优化系统得到了色谱峰-是

-否检查

HPLC系统6、反相HPLC方案的设计步骤3、做初次运行并根据谱图将样品分类等度洗脱可行的样品建议用梯度洗脱的样品反相保留太弱的样品改变pH、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱强保留样品用非水反相或正相条件复杂样品6、反相HPLC方案的设计步骤4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳B%步骤5、评价第二次运行中峰的质量--柱效、峰宽、峰形

★峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、pH、添加剂等）

★运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间步骤6、

★对等度方法，可以改变ACN%来改善峰间距和分离度★若有必要，将ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeOH%★可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化步骤7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件6、反相HPLC方案的设计步骤8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度

★结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型★分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件步骤9、对梯度方法，改变初始和最后的B%、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间步骤10、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间项目三：家禽用饲料品质检验分离系统常见故障1、手动进样器常见故障侧面（或接口处）渗漏转子密封垫圈松紧不合适垫圈不配套组装不对解决办法重新组装堵塞,样品打不进去样品管堵塞解决办法环管用反冲法或超声清洗排除（或换新管)1、手动进样器常见故障装样时针头周围渗漏孔道堵塞放空管和样品管太细，阻力太大针头密封管规格不对，针头太细放空管有虹吸现象转子密封面上孔之间有磨损解决办法清洗进样阀更换进样针为防止虹吸,放空管末端应在放空瓶液面以上更换磨损的转子1、手动进样器常见故障样品滞留阀在进样位置停留时间不够残留样品留在样品环中或注射器中，或从放空管中虹吸回来，污染下一个样品管路接头有死体积滞留样品，很难冲洗干净解决办法要求停留时间至少应让流动相流过的体积是环体积的10-20倍，一般是在下一针进样前才将阀扳到装样位置可用5-10倍的流动相或新样品冲洗注射孔和注射器，若是虹吸，应加限制管应检查装配情况，确定是否需换新配件2、自动进样器常见故障样品瓶不配套

瓶小——针弯、折断瓶大——样品少，抽不上样瓶破碎解决办法更换合适的样品瓶进样器针头堵塞样品、缓冲盐、隔垫碎片、针头本身解决办法可用溶剂清洗，金属丝疏通，或换新针头2、自动进样器常见故障样品滞留空白溶剂出现色谱峰解决办法样品瓶隔垫污染加倍清洗调整进样顺序，从低浓度开始，高浓度放后面在样品瓶前放清洗液瓶3、色谱柱常见故障故障现象解决办法过滤片堵塞压力增高、n下降、峰形差倒柱冲洗或换过滤片柱头塌陷峰分叉、n下降修补柱头键合相流失保留值改变、峰形差、n下降换柱样品堵塞压力高用能溶解样品的溶剂冲洗强吸收样品n下降、保留值小强溶剂反冲3、色谱柱常见故障问题塔板数下降样品处理不合适，选择适当的样品净化方法，选择合适流动相

柱头塌陷，填装修补问题峰形变坏

出现拖尾峰，分叉峰，非高斯峰，与塔板数下降有关

峰形坏但保留时间不变，可能是柱堵塞（不锈钢烧结片，更换过滤片），或柱头有空穴，填装修补3、色谱柱常见故障问题柱压突然增大滤片被流动相或样品中颗粒堵住

用0.25µm滤膜除去微量杂质

样品沉积在柱内

用能溶解样品的溶剂冲洗（断开柱和检测器的连接）,可正向冲，反向冲

柱内硬件有问题：

滤片堵塞，换新片或清洗

塌陷，用相同填料填充、修补柱床膨胀不可逆吸附细菌生长使用1：1的硝酸溶液超声清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份3、色谱柱常见故障问题保留时间改变不同柱保留时间的变化，主要是填料差异造成的不同牌号柱出峰顺序不变，保留时间有小的变化若峰顺序变化，保留时间变化较大

考虑换柱或优化分离条件新柱柱效低柱外死体积大

更换连接管，重新连接色谱柱，降低死体积样品在流动相中溶解不好，影响传质过程

使用合适的流动相或使用流动相溶解样品问题3、色谱柱常见故障问题旧色谱柱柱效低，分离不好柱入口床层塌陷

用同型填料填补柱效可部分恢复填料被流动相溶蚀而流失

对硅胶质填料，流动相PH值在2—7范围内，否则可能被溶蚀旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰柱入口填料被污染变质

用强溶剂冲洗

刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复

污染严重，则废弃或重新填装问题3、色谱柱常见故障问题新柱接到仪器上后，柱头漏液柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够

用扳手顺时针方向拧紧1／4圈直到不漏液为止问题新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干

继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉流动相脱气不彻底，特别是MeOH／H2O体系由于氢键作用很容易出现气泡配好流动相后一定要进行脱气处理3、色谱柱常见故障问题新柱接到仪器上后，启动仪器没有柱压降柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干

继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉问题新柱接到仪器上后，柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限柱入口滤片被固体颗粒堵塞更换或清洗柱入口滤片柱入口滤片被霉菌堵塞

用0.25µm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物3、色谱柱常见故障问题进样次数增加柱压降逐渐增加样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物

用0.25µm过滤膜过滤样品样品在流动相中析出微小结晶

推荐使用流动相溶解样品问题进样量增大与峰面积增加不成正比，即进样量与峰面积不是线性关系样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲入色谱柱中，而另一部分则沉积在柱入口端

用流动相溶解样品

样品的浓度不宜太大

进样量不宜过大3、色谱柱常见故障问题柱使用一段时间后，柱效下降，出现双峰柱入口床层被污染使柱填料变质用强溶剂冲洗除去杂质问题柱使用一段时间后，柱效下降，出现峰拖尾柱入口床层被污染

用强溶剂冲洗20-30min，若效果不明显应废弃问题使用—段时间后，柱效下降，分离不好柱填料被流动相溶解而流失如柱床层塌陷，用相同型号填料填补柱填料被样品杂质污染

推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质3、色谱柱常见故障问题用5µm颗粒填料柱时，以MeOH／H20作流动相柱压较高

MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大可用乙腈／水体系使柱压降低，分离效率更好问题使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快霉菌生长所致

如流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长实验结束后按要求用MeOH和水冲洗后关机问题流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来，不影响柱的性能3、色谱柱常见故障问题柱使用一段时间后保留值逐渐缩短柱中固定相流失所致

更换色谱柱

检查所用的色谱条件是否合适问题在UV色谱图中，靠近死时间处出现负峰进样时压力波动所致

采用阀进样样品溶液比流动相的UV吸收值低采用流动相溶解样品项目三：家禽用饲料品质检验检测系统常见故障1、紫外检测器常见故障灯故障:基线噪声大，灵敏度低氘灯寿命:1000h；汞灯和钨灯寿命:2000h

一般使用6个月以上可能接近寿命期限,可以考虑更换新灯流通池流动池内有气泡

脱气甲醇，不同流量冲洗

池堵塞（入口、出口、池内）

用可溶堵塞物的溶剂冲洗（缓冲盐用水冲洗）

池污染

异丙醇、二氯甲烷、6mol/LHNO3

冲洗1、紫外检测器常见故障量池和参比池失配

UV以空气为参比，一般不扣流动相本底若用有紫外吸收的流动相，参比信号不为零，会出现倒峰和伪峰

此时，选择合适的流动相时间常数选择（可过滤噪声）时间常数太小,噪声增大时间常数太大,出现宽峰、拖尾或矮峰

时间常数的设置一般根据经验估计，小颗粒柱常数小，可选最窄峰宽的1/10作为时间常数，对4.6×(150-250)mm，5um柱，可选0.5sor1s2、其他故障响应值超出线性范围样品量太大检测器的衰减超出了其线性动力学范围流动相的紫外吸收比较强温度影响环境温度变化引起基线漂移流动相温度变化引起折射率改变，紫外光传导变化柱温变化引起基线漂移2、其他故障信号线故障记录仪和数据处理系统信号线插接不紧，接触不良，信号很弱，出现不需要的噪音，此时按说明书检查线路连接。地线对仪器很重要,仪器外壳和信号线的接地很严格，接地不良会出现较大的基线噪声，接错线会造成短路，烧毁仪器。波长问题次级发射效应：用氘灯作可见光范围的光源时会发生次级发射效应，用钨灯没有此影响。正确选择波长：既照顾到灵敏度，又考虑到稳定性。波长校准：机械转动光栅选择波长，因磨损造成所选波长与刻度盘上的不一致，而且重复性也差。项目三：家禽用饲料品质检验输液系统常见故障1、储液器常见故障脱气不充分（噪声大，出毛刺）

用He脱气，真空脱气，超声脱气，加热回馏脱气（混合流动相不宜）流动相供给不畅，泵压力不稳流动相接近用完过滤器堵塞（有颗粒，长霉）流速过高，阻力大，造成空化现象。解决办法重新脱气解决办法降低流速；换大孔过滤器；加大管路内径；抬高储液器1、储液器常见故障储液器或流动相被污染（产生有规则的噪声；基线上升，梯度洗脱出鬼峰）

溶剂质量差（含杂质多）配流动相的玻璃器皿不合格，微生物影响

配制流动相的操作不当（过滤、脱气、搅拌）解决办法清洗相关玻璃器皿、更换高质量试剂、重新配置2、输液泵常见故障球和阀座粘在一起，堵死，打不出溶剂（无流动相流出）

*这种情况一般发生在使用缓冲盐流动相时解决办法用高质量的溶剂冲洗，不同极性溶剂冲洗,如水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷···，更换新单向阀。球和阀座密封不严，压力不稳，气泡进入阀中，紧贴在阀体内，使球难以返回阀座，引起倒流，压力和流速变化大

*阀中可能有小晶体颗粒解决办法打开排液阀，大流量冲洗，用脱过气的甲醇冲洗，一般可解决问题。2、输液泵常见故障泵垫圈磨损或破碎：高压下压力不稳，从泵头往外渗漏流动相，色谱峰的保留时间改变解决办法更换新垫圈。更换方法按维修说明书上的方法一步步操作。注意输液泵的垫圈要和流动相匹配协调。多数垫圈和流动相是协调的,但有的垫圈适用于甲醇、水、乙腈，在四氢呋喃中溶解、变粘、变软。2、输液泵常见故障柱塞杆故障磨损、漏液使用不当被折断柱塞杆被卡住，不能运动解决办法更换柱塞杆。请维修工程师帮助解决，或参照专门的操作手册自己动手更换。项目三：家禽用饲料品质检验液相色谱常见的一些故障基线噪音可能的原因：

﹠流动池脏

﹠检测器灯有问题

﹠如果是周期性的，电压或泵的脉冲

﹠温度对检测器的影响

﹠气泡经过检测器Time(min.)基线漂移可能的原因：

﹠梯度洗脱﹠温度不稳定(示差检测器）﹠流动相中有污染物﹠柱中的流动相没有平衡﹠体系中有污染物流出鬼峰即使不进样也会出现的峰问题1-流动相脏问题2-容器污染问题3-柱子污染20%-100%MeOH没有进样60153015037