超氧化物歧化酶的研究进展

超氧化物歧化酶的研究进展

生物在正常生活活动过程中伴随着氧气代谢，产生了活性氧。生物体具有十分完善的活性氧清除体系,包括各种抗氧化酶类和抗氧化物,故正常生理条件下机体的活性氧处于动态平衡状态。但在病理状态下或逆境条件下,机体内活性氧代谢有可能失衡,导致活性氧积累而引发氧化损伤,加速衰老或导致疾病。超氧化物歧化酶(SOD)是生物抗氧化酶类的重要成员,它能够清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基(O-2),是生物体有效清除活性氧的重要酶类之一,被称为生物体抗氧化系统的第一道防线。自1969年McCord和Fridovich从牛红血细胞中发现SOD以来,SOD的研究就成为了生物学的前沿课题之一。人们通过对SOD的广泛深入的研究,极大地丰富和推动了自由基生物学的飞速发展。目前,对SOD的研究已从抗氧化及抗衰老机制拓展到化妆品、食品和医药等方面的应用研究,并已开始应用于研究新一代生物传感器。1真核生物的酶1938年Mann和Keilin从牛血红细胞中分离出含Cu的蛋白,并命名为血Cu蛋白。1969年,McCord和Fridovich发现血Cu蛋白是一种能将O-2催化成H2O2的酶,并正式命名为超氧化物歧化酶。按照SOD中金属辅基的不同,大致可将SOD分为三大类;第一类是CuZnSOD,广泛存在于真核生物中,一个酶分子的亚基含一分子Cu和一分子Zn,Cu位于酶的活性中心,酶的形状呈一椭圆形狭长的口袋,Cu位于“口袋”的底部,与一分子水和4个组氨酸(His)残基形成配位键,Zn则通过咪唑基与其中之一的His残基相连;第二类是MnSOD,存在于真核生物的线粒体和原核生物的胞浆中;第三类是FeSOD,存在于叶绿体和原核生物中。此外,人们还从牛肝中发现了一种CoZnSOD。将Co与CuZnSOD中的Zn置换,形成CuCoSOD,仍能保持原来酶活性的90%,但在生物体内目前还没有发现CuCoSOD。还有报导称生物体内可能还有一种与CuZnSOD结构相似的NiSOD,但与CuZnSOD无同源性,为二聚体,其中每个亚基含一分子Ni,Ni与一分子的蛋氨酸(Met)残基和两分子半胱氨酸(Cys)的S形成配位键,与另一个与Cu结合的His残基的N形成配位键。2氧自由基传感器的研究SOD作为专一清除O-2的酶,能够催化如下反应:对于CoZnSOD而言,所催化的歧化反应为二级反应,即反应的速度与双底物的乘积成正比。一般而言,H2O2能够抑制该酶的活性,一是由于产物抑制,二是由于H2O2能够改变酶的构象,影响酶活力。另外,多余的H2O2能够转化为OH·,使酶蛋白变性和核酸突变,降低酶的活性。自Oberley1985年提出环式氧化还原电子传递途径的歧化反应的电化学设想以来,人们主要通过研究离体SOD在电极上的电化学行为来探讨电子传递的机理,以促进新一代超氧化物自由基传感器的开发与研究。Lyer等在pH4.0的磷酸缓冲液中观察到裸露的金电极吸收电子后,CuZnSOD从还原态不可逆地转化成氧化态,且酶的活性中心的构象发生了变化。Yang等通过对牛红血细胞CuZnSOD在用半胱氨酸单分子自组膜(self-assembledmonolayer,SAM)修饰后的金电极上的电化学研究,发现有SAM的金电极吸收电子的能力明显提高。Yang等将Cys的巯基与Au相连,Cys的-NH2与-COO不是直接与酶的活性中心相连,而是与酶的Thr135的-OH和Arg141的两个-NH2之一分别形成氢键,这样经过Cys修饰的酶使酶椭圆形狭长的口袋的口子增大,仍具有歧化酶活性,同时减弱了Thr135的-OH与酶上其他氨基残基形成氢键的能力。实验说明,Cys是使电子从Cu活性中心直接传向金电极的促进物。如果把CuZnSOD中的Zn除去,酶的活性下降不大,也能得到相似的结果;反过来用只含Zn的SOD,则不能形成电位差,说明Zn不参与氧化还原中的电子传递过程。有趣的是SOD虽是自然界唯一清除O-2的酶,却也能以NO-为底物,在有氧条件下和无氧条件下分别催化如下反应:NO-+O-2+2H+→NO+H2O2NO-+NO-+2H+→H2N2O2(H2N2O2随后水解成N2O和H2O)Stefan认为,在有氧条件下,NO-与NO形成N2O-2,N2O2才是氧化型SOD的电子供体。3干旱胁迫对植物抗氧化酶系统的影响在同一时期不同的组织器官中和不同时期同一组织器官中,SOD同工酶的活性表达有很大的差异。就杂交水稻SOD同工酶谱带而言,CuZnSOD为2到4条不等,MnSOD为1条或没有,不同的水稻品种的SOD同工酶谱带有所不同,同一品种在不同蹬时期SOD同工酶谱带也有所不同,且这两种SOD同工酶在水稻中表现出很强的器官特异性,即它们在根、茎、叶中的活性和电泳谱带有所不同。上面这些研究结果反映了各种水稻品种不同的遗传背景,也反映了SOD基因在植物的生长发育的不同时期表达的先后顺序及表达的程度不同。也有人认为这种表达差异与细胞在生长发育的不同时期受到不同程度的氧化胁迫有关。对植物干旱的脱落酸(ABA)应答途径已有了比较深入的研究。干旱信号首先激发ABA合成,ABA再使细胞的Ca2+水平上升,激活反式作用因子,反式作用因子与特定的顺式作用元件结合,诱导基因的表达。有人认为,干旱胁迫的基因产物能诱导SOD的表达,提高细胞的抗氧化排毒能力。Yu等对羽扇豆的研究表明,Zn、Cu、Mn可明显调节SOD的活性。当植物处于缺乏Zn、Cu、Mn的环境中,SOD活性下降;当处于富含Zn、Cu、Mn的环境中,SOD活性上升。因此,Zn、Cu、Mn的含量与SOD的活性有很强的相关性,但到底是由于微量元素的缺乏造成活性氧的增多,再由活性氧激活SOD的表达,还是这些元素通过其他的途径调控SOD活性,目前还不十分清楚。Guan等认为植物内源激素能够调节SOD的表达,他们在玉米中找到9种SOD同工酶:在细胞质中4种CuZnSOD同工酶(SOD-2,SOD-4,SOD-4A和SOD-5),线粒体中4种MnSOD同工酶(SOD-3.1,SOD-3.2,SOD-3.3和SOD-3.4),叶绿体中1种CuZnSOD同工酶(SOD-1)。通过对编码SOD-4和SOD-4A的基因Sod4和Sod4A的研究发现,ABA能够在胚和幼叶中提高Sod4A的转录水平。他们认为,响应ABA造成的Sod4mRNA量的上升是由于与ABA代谢相关的变化造成超氧化物自由基水平发生变化,诱导抗氧化保护酶系统的表达。而渗透胁迫并不能提高SOD基因的表达水平,故玉米对渗透胁迫的应答机制与对ABA的应答机制并不相同。Camp等的实验表明,烟草胞浆中为CoZnSOD严格地受生长发育和环境因子的调控。烟草有3种SOD同工酶形式:胞浆中为CuZnSOD,叶绿体中为CuZnSOD和FeSOD,线粒体中为MnSOD。烟草的这三种SOD的表达调节机理各不相同,胞浆中的CuZnSOD受热激和超氧化物自由基的调控;FeSOD主要受光合作用的调控;MnSOD主要与线粒体的呼吸代谢有关。4补充菌株中sod基因的表达目前,在基因库中已经登记的SOD基因已有上千个,来自各种微生物、动物和植物等,并有多种SOD已经在大肠杆菌、酵母等载体中得到表达,在植物中也得到多种SOD的cDNA克隆并转化成功了不同的植株,获得了SOD活性增强转基因植株。通过对转SOD基因种子的水培试验,发现转基因烟草植株能在叶绿体中过量表达FeSOD,在叶绿体和线粒体中过量表达MnSOD,其SOD活性都比没经转化的对比植株高许多。在缺Mn的环境中,转化后的植株的耐受力高于未经转化的植株,说明转基因植株中SOD的过量表达能够有效抵御由于缺Mn造成的氧化胁迫。从水稻中克隆的CuZnSOD基因,能在大肠杆菌中表达,CuZnSOD的含量增加20%,得到的融合蛋白对脂质过氧化的抗性高于水稻中的胞质CuZnSOD,并且能通过得到的融合蛋白来制备SOD酶的抗血清,用以检测其他植物品种的SOD。5cuznsod基因序列的同源性和进化的稳定性从分子进化的水平对SOD进行研究,有助于进一步了解不同种类SOD的起源、结构与功能的关系以及它们面对不同胁迫环境的作用机理。SOD的分子进化主要通过分析不同物种SOD基因编码序列和内含子的数量、位置以及SOD的氨基酸残基的排列顺序,研究不同物种的亲源关系,绘制进化树。Fink等研究了包括动物、植物、微生物在内的一百多个物种的SOD及其编码基因,发现不同植物CuZnSOD的氨基残基的序列有很高的同源性,且植物的CuZnSOD与其他物种的CuZnSOD也有较高的同源性,在进化上较为保守。植物胞浆与叶绿体中的CuZnSOD氨基酸残基排列各有不同的特点,但从对玉米叶绿体SOD-1的分析发现,该酶在一级结构上同时具有叶绿体CuZnSOD和胞质CuZnSOD的特点,提示胞质和叶绿体中CuZnSOD可能源于同一祖先,后来在进化过程中被细胞隔开而产生了变异。植物CuZnSOD基因内含子的数量和位置相当保守,例如编码胞浆中SOD的基因有7个内含子,编码叶绿体SOD基因一般有8个内含子。编码植物MnSOD的基因的内含子的数量和位置也是高度保守的,但编码动物MnSOD基因的变化要大一些,不同物种的MnSOD同源性高于FeSOD。真核生物的MnSOD与某些细菌特别是古细菌的MnSOD相似,这一事实有力地支持了内共生学说。该学说认为