i标记抗人adam15多克隆抗体在荷人胃癌裸鼠体内的生物分布

i标记抗人adam15多克隆抗体在荷人胃癌裸鼠体内的生物分布

由于脾胃疾病严重，治疗难度大，预后差。因此，寻找特定的诊断和治疗非常重要。金属蛋白酶去整合素家族(adisintegrinandmetalloproteinase,ADAM)是近年来发现的一类跨膜糖蛋白家族,具有蛋白水解、细胞外基质降解、生物活性因子释放、细胞附着、融合、迁移、信号传导等功能。去整合素金属蛋白酶15(ADAM15)与人类多种实体瘤如胃癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌等的发生和发展密切相关,同时在肿瘤血管再生过程中起到必不可少的作用。本研究用125I标记抗人ADAM15多克隆抗体(anti-ADAM15抗体),研究其在荷胃癌裸鼠体内的分布,为应用放射性核素标记anti-ADAM15抗体进行胃癌放射免疫显像和放射免疫治疗奠定基础。1材料和方法1.1实验动物及食物anti-ADAM15抗体由江南大学提供;胃癌细胞株HGC-27由本实验室保存;BALB/c裸鼠由中国科学院上海实验动物中心提供,4周龄,体质量16～20g,SPF级环境中饲养,恒温25～27℃,恒湿45%～50%,饮用水及食物均经灭菌。Na125I(成都中核高通同位素股份有限公司),氯胺-T(Sigma公司,美国),偏重亚硫酸钠(Fluka公司,德国),SephadexG50(GE公司,美国)。其余试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1标记物的制备取0.05mol/L、pH7.5的PB100μl加入放免试管中,然后依次加入待标记的抗体20μl(1.2mg/ml)、2.03GBq/ml(54.9mCi/ml)Na125I溶液10μl、氯胺T溶液(2mg/ml)50μl,磁力搅拌器搅拌反应5min;加入偏重亚硫酸钠溶液(2mg/ml)100μl反应1min完成标记实验。将反应液用SephadexG-50柱纯化,用0.05mol/L、pH7.5的PBS洗脱,收集洗脱液10滴/管,测量放射性活度。取峰值洗脱液测定纯化后的标记物放射化学纯度,纸层析法测定放射化学纯度,新华1号层析纸为固定相,生理盐水为展开剂,标记物Rf值为0.0～0.1。将洗脱液过滤备用。1.2.2设定观察细胞测量取标记物50μl按体积比1∶20加入生理盐水和新鲜人血清中,封口后置入37℃细胞培养箱内,于1、4、8、24和48h时间点分别取出测定其放射化学纯度。1.2.3balb/c裸鼠前灰创新细胞的接种胰蛋白酶消化处于对数生长期的胃癌细胞株HGC-27,调整细胞浓度为1×107个/ml,抽取细胞悬液0.2ml接种于5周龄BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下。待瘤长到直径约为1cm时,用于SPECT显像实验。1.2.4spica法检测裸鼠体内放射性4只荷瘤裸鼠显像前三天每天用0.1g/ml碘化钾口服液200μl灌胃,经尾静脉注射125I-anti-ADAM15抗体3.7MBq(100μCi)。将裸鼠麻醉后,俯卧位固定,在注药后1、4、8、24和48h对裸鼠进行SPECT平面显像。采用低能平行孔高分辨准直器,能峰37keV,窗宽60%,放大倍数2.6,采集总计数为100k。制备1个标准源0.407MBq(11μCi)每次同时采集。用感兴趣区(ROI)技术进行半定量分析,计算肿瘤与非瘤组织的放射性计数比值(T/NT)和肿瘤与裸鼠全身的放射性计数比值(T/Total)。48h显像后处死动物,取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、血、肌肉、骨、甲状腺、胰腺和肿瘤等组织,称重并在γ计数仪上测其放射性计数,计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。1.3统计处理计量数据以x¯±sx¯±s表示,运用SPSS13.0软件进行单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1标记物的放射性化学纯度125I-anti-ADAM15抗体的标记率为(75.16±9.43)%,纯化后标记物的放射化学纯度为(99.44±0.21)%。标记物加入生理盐水和新鲜人血清后的放射化学纯度如表1所示。2.2肿瘤部位显像观察荷瘤裸鼠右侧腋下肿瘤部位在SPECT平面显像中显影清晰,标记物随时间的延长在肿瘤部位逐步浓聚(图1)。根据ROI半定量分析所得T/NT和T/Total值如表2所示。2.3id/g血、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、骨骼、甲状腺、脑、胰腺和肿瘤等脏器组织的每克组织百分注射剂量率(%ID/g)分别为17.47±4.07、5.22±1.54、4.78±1.50、6.98±1.10、11.08±2.55、6.25±1.50、2.75±0.79、2.88±0.90、1.95±0.79、2.70±0.97、12.75±7.56、0.51±0.09、2.81±0.65和8.59±1.49。3社区治疗后12h的热反应anti-ADAM15抗体是以重组人ADAM15蛋白为抗原制备的,用间接酶联免疫吸附试验检测它与胃癌细胞株HGC-27有结合。本研究采用氯胺T法标记该抗体,标记率高,纯化后标记物放射化学纯度可达(99.44±0.21)%,提示标记方法稳定可靠。标记物在生理盐水中放置48h后放射化学纯度仍在95%左右,提示其在生理盐水中很稳定。但在新鲜人血清中放置24h后放射化学纯度就有下降,在48h时放射化学纯度为(79.09±5.94)%,提示其在人血清中欠稳定,有脱碘显像,也有可能被血清中的酶分解。对荷人胃癌裸鼠进行SPECT显像结果显示,随125I-anti-ADAM15抗体静脉注入时间的延长,瘤体内放射性越来越高,T/NT逐步增高。在24h时肿瘤显影清晰但全身血本底较高,在48h时T/NT可达3.84±0.43。由于125I的物理半衰期为60d,给药后较长时间内仍然可以进行放射免疫显像,但本研究中由于SPECT设备需要检修,因此未进一步延时显像。48h后体内分布实验提示,肿瘤组织每克组织百分注射剂量率达8.59±1.49,这与显像结果是一致的。但血液、肺和甲状腺内每克组织百分注射剂量率较高,提示在体内有脱碘现象,与稳定性实验结果一致;而血液中每克组织百分注射剂量率较高,也可能是抗体与血液中蛋白结合后滞留在血液内所致,有待于进一步研究。本研究结果表明,125I-anti-ADAM15抗体在荷胃癌裸鼠体内具有肿瘤靶向定位能力,且在瘤内滞留时间较长