青蒿素对莲花隐杆线虫生殖的影响

青蒿素对莲花隐杆线虫生殖的影响

[通信作者]陈根，电子邮件：chengen。1材料表面1.1麻黄埃希菌尿丙烯酰胺啶渗突变型秀丽隐杆线虫(N2野生型)和OP50(尿嘧啶渗漏突变型)大肠埃希菌由美国线虫中心(CaenorhabditisGeneticsCenter)惠赠。1.2pcr扩增dh2po4-kh2po4/抓清剂/培养基溶剂配方1000ml培养基NGM中含3gNaCl,2.5g蛋白胨,17g琼脂,25mlk2HPO4-KH2PO4缓冲液(1mol/L),pH6.0,975mlddH2O,灭菌后加入抽滤除菌的1ml胆固醇溶液,1ml1mol/LMgSO4和1ml1mol/LCaCl2。2方法2.1冲下培养基内的l4期成虫用M9缓冲液(每升含15.12gNa2HPO4·12H2O,3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4·7H2O,0.12gMgSO4)冲下培养基中的L4期成虫。取3.5ml至离心管中,加碱裂解液(0.4g/mlNaOH与NaClO体积比为1︰2)至4ml,每隔2min震荡1次,约10min后,悬浊液变澄清,4000r/min(离心半径11.0cm)离心1min,用ddH2O漂洗2次后置于无菌NGM培养基上孵化过夜。2.2青蒿素的生长试验分青蒿素(美国Adams试剂公司产品)3、4、5mmol/L和对照组(0mmol/L)。将不同浓度的青蒿素加入NGM培养基中,接种OP50,37℃孵育过夜。挑取20条同步化后的L4期线虫入各实验组,25℃培育,每隔24h计数,每隔2d换一次培养皿。采用one-wayANOVA分析方法,使用SPSS11.0分析软件进行统计学分析。2.3rna的提取取约500条5mmol/L组刚进入成虫期的秀丽隐杆线虫,用M9缓冲液冲洗3次,或者用ddH2O在4℃沉降1h,1500r/min(离心半径11.0cm)离心3min,去上清,将虫体转移至无RNA酶的Ep管中,用trizol法提取RNA。提取的RNA用20μl无RNase水溶解,-20℃保存。2.4引物的设计与合成将得到的总RNA使用Takara公司PrimeScriptRTMasterMix试剂盒,反转录得到线虫的cDNA。反应体系(10μl):5×PrimeScriptBuffer2μl,线虫RNA1μl,加RNasefree的水至10μl。PCR反应37℃反转录15min,反转录酶85℃失活5s,4℃保存。参照GenBank,利用Primer软件,设计ama-1、ung-1、sec-23和lin-29的引物,其中ama-1为管家基因。引物由日本Takara公司合成。基因引物序列见表1。Real-timeRT-PCR是采用SYBRGreenⅠ方法,使用SYBRPremixExTaqⅡ(Takara)试剂盒,仪器为RocheLightCycler480(RocheAppliedScience)。反应体系(20μl):模板2μl,上、下游引物各0.8μl(10μmol/L),SYBRPremixExTaq10μl,加去离子水至20μl。实时荧光定量PCR反应参数:95℃预变性5min;95℃变性10s,61℃退火30s,72℃延伸10s,共40个循环;遵照△△ct法,使用罗氏分析软件进行分析(Rocheappliedscience)。结果1秀丽隐杆线虫的生殖3、4和5mmol/L青蒿素对秀丽隐杆线虫的生殖有一定影响,在体视显微镜下未观察到有卵产生或者幼虫,但2、1mmol/L或更低浓度时,秀丽隐杆线虫的生殖无明显影响,致死率也较低。故以5mmol/L青蒿素处理的虫株提取的总RNA与正常对照组。由图1可知3、4、5mmol/L青蒿素组秀丽杆菌线虫平均生存天数为3.65、3.25和2.65d,与正常对照组4.3d比较均有一定程度的降低。2rna的运用提取的秀丽隐杆线虫RNA1%琼脂糖电泳结果见图2。RNA为3条带,从上至下分别为28S、18S和5S。样品经核酸定量仪ThermoNanodropND-2000C检测,A260/A280值1.9～2.0。3荧光定量动力学曲线分别将处理过的样品和对照品按照20μl体系配制,ama-1作为管家基因,在RocheLightCycler480荧光定量仪上进行扩增,得到平行反应扩增过程的S型荧光定量动力学曲线(图3)。所有曲线拐点清楚,指数增长期明显。曲线指数期扩增斜率大,说明扩增效率高。复孔重复性高。4个基因的溶解曲线主峰位置重叠,窄且尖,无杂峰,引物特异性较好(图4)。4pcr扩增长度结果见图5。M泳道为Marker,1～4泳道为lin-29PCR产物长度为129bp,5～8泳道为sec-23PCR产物长度为108bp,9～12泳道为ung-1PCR产物长度为86bp。5基因组织调节型处理组与对照组相比,ung-1和lin-29基因表达上调,sec-23基因表达下调。由此可以得出ung-1、lin-29和sec-23在线虫的生殖与发育过程中均参与调节作用,并且ung-1和lin-29表达上调,sec-23表达下调(P<0.05)(图6)。6虫体幼虫wrms在5mmol/L青蒿素组发现由头到尾充满线虫虫体的幼虫,称为“bagofworms”(图7)。可能是药物对线虫的外生殖器产生作用,导致虫卵难以排出或者影响了线虫的神经调节而出现的现象。青蒿素对秀丽隐杆线虫生殖的影响青蒿素的烷基化作用是青蒿素的抗疟机制之一。新的酯类化合物抗疟效价更高。青蒿素可使红细胞中H2O2和O2等活性氧的浓度升高,并能增加红细胞膜的脂质过氧化,从而可直接杀伤疟原虫,其氧化产物也可直接作用于疟原虫,使红细胞损伤、破溶而导致疟原虫死亡。青蒿素类药物有抗血吸虫作用,在整个服药阶段均可杀灭幼虫期血吸虫。青蒿素还能杀灭进入宿主体内的幼虫;对疫水接触者具有保护作用;用于感染日本血吸虫尾蚴后的早期治疗,可降低血吸虫感染率和感染程度,并可预防血吸虫病的发生。青蒿素抗血吸虫活性基团是过氧桥,青蒿素作用机理是影响糖的代谢。研究发现,肝期血吸虫经青蒿素的衍生物蒿甲醚作用后糖元减少,碱性磷酸酶活力受到抑制。体表肠管和生殖腺明显退行性变,虫体变细,蛋白质含量明显减少,尤以雌虫更明显。本研究用3、4、5mmol/L青蒿素处理秀丽隐杆线虫,均可缩短线虫的寿命,并能完全抑制线虫的繁殖。研究表明lin-29在幼虫的第一阶段被检测到并且从开始到最后蜕皮阶段显著增加,说明lin-29的表达是线虫终末分化所必须的条件。let-23编码的蛋白是表皮生长因子受体家族的跨膜络氨酸激酶,主要涉及到秀丽隐杆线虫的外阴发育。UNG-1蛋白是一种活化的尿嘧啶-DNA糖基化酶,在细胞内有助于修复电离辐射诱导的DNA碱基损伤。Desalermos等发现用5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理过的线虫lin-29与let-23表达均为上调,并且浓度越高,上调的幅度越大。Kim等证明5-Fu能抑制线虫的生殖率并能介导线虫精细胞的死亡,Dengg等也证明dUTPase的消耗导致尿嘧啶的升高,干扰线虫的性腺、生殖器的发育和形成。线虫的排卵和神经调节也有一定的作用。5-Fu有损伤DNA的作用,通过DNA损伤反应,导致细胞的凋亡,因为5-Fu在哺乳动物细胞中有抑制TGF-β的作用。在青蒿素及其衍生物中也观察到类似的想象。本实验结果显示sec-23表达下调,lin-29与ung-1表达均上调,其中lin-29的上调与文献实验结果一致。由此判断青蒿素对秀丽杆菌线虫生殖