护肝片对中、晚期纤维化大鼠肝星状细胞活化增殖及nf-b及gf-1表达的影响

护肝片对中、晚期纤维化大鼠肝星状细胞活化增殖及nf-b及gf-1表达的影响

肝纤维是肝慢性损伤后的一种修复反应。这是慢性肝炎发展到肝硬化的必要阶段。其主要特点是精细胞外基质（em）的合成和分解失衡，导致em在子周围空间的大量积聚。肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSC)是肝纤维化时ECM过多产生和沉积的主要细胞来源,HSC的激活、增殖及ECM的过量沉积在肝纤维化过程中起核心作用。核转录因子-κB(nuclearfactorκB,NF-κB)是一种具有转录激活功能的蛋白质,普遍存在于多种组织的多种细胞中。体外研究发现NF-κB可能参与调控了肝纤维化过程中的枯否氏细胞(Kupffercells,KC)和肝星状细胞的活化。转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-beta1,TGF-β1)是强有力的致纤维化的细胞因子,促进HSC增殖活化,在纤维化进程中起重要作用。护肝片抑制纤维化肝组织TGF-β1及TβRⅠ蛋白的表达,为此,本研究拟就护肝片对中晚期纤维化大鼠肝组织HSC与NF-κB、TGF-β1及TβRⅠmRNA表达的影响进行观察,进一步探讨其抗肝纤维化作用机制。材料和方法1.大鼠分组、模型组、护肝片组igSD大鼠54只,雌雄兼用,体重150-180g,由上海西普尔-必凯实验动物中心提供(清洁级),标准饲料,自由饮水。随机分成两大组:模型复制8与13周,均各设正常组、模型组和护肝片(921mg/kg)组。自模型复制之日起,除正常组外,各组大鼠按100g体重0.5ml背部皮下注射10﹪CCl4精制花生油溶液,每周2次,分别连续8与13周。灌胃(ig)给药,每天1次,正常组与模型组ig等容量5g/l羟甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,直至8周或13周。分别在实验的第8、13周末处死动物,取左叶肝组织常规10﹪甲醛溶液固定,石蜡包埋,4μm连续切片,HE染色,光镜观察。2.集目标组织整合式组织芯片的制作HE染色切片在光镜下用定位器定位后,通过打孔、定位、取样、点样,从供体蜡块中的相应部位采集目标组织整齐包埋于受体蜡块中,制成组织片直径为1mm、间隔1mm的组织芯片。4μm连续切片,贴附于经10﹪多聚赖氨酸防脱片预处理的载玻片上,分别作苏木精-伊红(HE)染色、网状纤维染色、VanGieson(VG)胶原纤维染色、免疫组织化学染色和原位分子杂交。3.羊抗actin、兔抗nf-bp65的研究与试剂采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复,S-P法免疫组织化学染色,用DAB/H202显色,苏木精复染。羊抗Actin(Ⅰ-19)、兔抗NF-κBp65多克隆抗体均购于SantaCruz,兔S-P法(SecondGenerationLAB-SA)Kits试剂盒为美国Zymed公司产品。具体操作遵试剂盒说明书,用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。4.tr靶基因的检测TGF-β1及TβRⅠ的寡核苷酸探针均经地高辛标记,显色系统为生物素化鼠抗地高辛和过氧化物酶标记链霉卵白素(SABC),DAB显色。针对TGF-β1靶基因的mRNA的探针序列为:(1)5′-ACCTGCAAGACTATCGACATGGAGCTGGTG-3′;(2)5′-TGTACAACAGCACCCGCGACCGGGTGGCCG-3′;(3)5′-GTACCAGAAATACAGCAACAATTCCTGGCG-3′。针对TβRⅠ靶基因的mRNA的探针序列为:(1)5′-TAGCTGAAATTGACTTAATTCCTCGAGATA-3′;(2)5′-GTGTCAGATTATCATGAGCATGGATCCCTT-3′;(3)5′-GTATGCCAATGGAGCAGCTAGGCTTACAGC-3′。TGF-β1及TβRⅠ的原位杂交检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。具体操作遵试剂盒说明书,用已知阳性切片作为阳性对照,用预杂交液代替杂交液作阴性对照。5.原位杂交染色结果肝纤维化病理学分级为0-Ⅵ级。α-SMA免疫组化染色以细胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性,200倍光镜下任选3个250μm×250μm范围计数α-SMA阳性细胞来判断结果。NF-κB以细胞浆和∕或细胞核内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性;TGF-β1及TβRⅠmRNA的原位杂交染色结果,以胞浆内或胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性。EclipseE800型光学显微镜(日本Nikon)(×400)下任选取3个视野用SpotAdvanced显微摄像系统(美国DiagnosticInstrumentsInc)拍摄照片,用4.01版MetaMorph图像分析系统(美国UniversalImaging公司)进行显微定量分析,分析每个组织片上NF-κB蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的平均灰度值(Averagegrayvalue,AGV)和平均光密度值(Meanopticaldensity,MOD)。6.统计处理运用SPSS(11.0forwindows)软件对数据进行统计学处理。计量资料间比较采用t检验和onewayANOVA检验。ccl4所致纤维化大鼠肝组织-sma的表达情况1.护肝片对CCl4性纤维化大鼠肝脏病理学改变的影响HE、网状纤维及VG胶原纤维染色结果见表1。正常组肝小叶结构完整,肝细胞排列整齐,无炎细胞浸润,模型组大鼠在模型复制8、13周均可见肝细胞脂肪变性、水变性和点状坏死、碎片状坏死,13周时胶原纤维增生形成完整的纤维间隔,并分割肝小叶形成假小叶,纤维间隔内可见慢性炎细胞浸润。在模型复制8、13周,护肝片组肝细胞的水变性、脂肪变性、炎细胞浸润及纤维组织增生均轻于模型组。模型复制8、13周,正常组与模型组肝纤维化分级比较,差异有显著性(P<0.01)。2.α-SMA阳性细胞在正常及纤维化大鼠肝组织中的分布及护肝片对其数量的影响HE染色结合免疫组化染色结果观察显示,α-SMA阳性细胞位于窦周Disse间隙,形态不规则,胞体呈卵圆形或不规则。正常组、模型组及护肝片组肝组织中均有α-SMA阳性细胞,但其数量明显的不同(表2)。大鼠CCl4性肝纤维化8周、13周,模型组α-SMA阳性细胞数均明显高于正常组,且模型组的α-SMA阳性细胞数8周明显高于13周。大鼠CCl4性肝纤维化8周、13周,护肝片组肝组织α-SMA阳性细胞数量均显著低于模型组。3.NF-κBp65蛋白在CCl4性纤维化大鼠肝脏组织和细胞中的分布及护肝片对其表达的影响正常对照组大鼠肝组织较少表达NF-κBp65蛋白(图1,图4),模型组大鼠肝组织则有较强的NF-κBp65蛋白表达,分布在细胞浆、细胞核中(图2,图5)。NF-κBp65蛋白的阳性染色分布于纤维化区、肝窦壁、血管壁及部分胆管细胞,脂肪变性和水变性表2护肝片对CCl4所致纤维化大鼠肝组织α-SMA阳性细胞数量的影响(单位:个)的肝细胞也可见阳性染色。表3显示,大鼠CCl4性肝纤维化8、13周,模型组肝组织NF-κBp65蛋白的表达量显著高于正常组。模型组肝组织NF-κBp65蛋白的表达量8、13周相比差异无显著性。大鼠CCl4性肝纤维化8、13周,护肝片(图3,图6)显著地抑制纤维化肝组织NF-κBp65蛋白的表达(P<0.01)。4.TGF-β1及TβRⅠ的mRNA在CCl4性纤维化大鼠肝脏组织和细胞中的分布及护肝片对其的影响正常肝组织不表达或仅微弱表达TGF-β1及TβRⅠmRNA,它们分布于胞质和∕或胞核内(图7,图10,图13,图16);模型组(图8,图11,图14,图17)和护肝片(图9,图12,图15,图18)组肝组织均有较强的TGF-β1及TβRⅠmRNA表达,主要分布在细胞质及细胞核上。TGF-β1及TβRⅠmRNA的阳性染色分布于变性的肝细胞、纤维化区、肝窦壁、血管壁及部分胆管细胞。表4显示,大鼠CCl4性肝纤维化8周、13周,模型组肝组织TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达量均显著高于正常组。模型组肝组织,TGF-β1mRNA的表达量13周显著高于8周,TβRⅠmRNA的表达量8周显著高于13周。大鼠CCl4性肝纤维化8周、13周,护肝片组肝组织TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达量均显著低于模型组,但仍显著高于正常组。5.相关分析表5显示,大鼠CCl4性肝纤维化8周,正常组、模型组及护肝片组大鼠肝组织的α-SMA阳性细胞数、NF-κBp65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA表达量相互间均呈显著正相关。大鼠CCl4性肝纤维化13周,除α-SMA阳性细胞数与TβRⅠmRNA表达量之间不相关之外,其余各数据之间均呈显著正相关。肝纤维化中hsc的表达及变化中药护肝片(黑龙江葵花药业股份有限公司)是糖衣片,由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆组成,有抗肝纤维化作用。本模型采用12.5%CCl4致大鼠肝纤维化的一般病理学改变结果显示,造模8、13周,模型组肝组织正常肝小叶结构被破坏消失,汇管区和中央静脉区胶原纤维增生,分割肝小叶形成大方形及小方形假小叶,模型组的肝损伤及其纤维化分级均显著高于正常组,表明CCl4致大鼠肝纤维化造模成功。8、13周模型组肝损伤的病理组织学变化及纤维化分级间无明显差异,但13周较8周有发展加重趋势,这与8周肝纤维化已经形成,而晚期(13周)肝纤维化可能处于相对稳定状态、胶原的合成与降解达到新的平衡有关。护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组,进一步证实护肝片对大鼠CCl4慢性肝损伤及其纤维化形成有抑制作用。肝纤维化是肝脏对各种损伤的修复反应,在肝脏炎症损伤过程申,HSC活化发生表型转变而具有肌成纤维细胞(MFB)的特性,使ECM-胶原蛋白合成增加,细胞收缩性增强,在肝纤维化的形成中发挥关键作用,HSC活化是肝纤维化形成过程的中心环节,α-SMA是其活化的标志。本实验用12.5%CCl4致大鼠慢性肝损伤,α-SMA染色结果显示,造模8、13周,模型组肝组织活化的HSC(即α-SMA阳性细胞)数量均较正常组显著增多,这与文献报道一致。证实在肝纤维化过程中活化的HSC数量增多,即HSC被活化并大量增殖。在大鼠CCl4性肝纤维化8、13周时,模型组有明显的肝纤维化形成,表明HSC的活化、增殖与ECM的沉积的现象是一致的,两者关系密切。本次实验中,出现13周模型组活化的HSC数量较8周显著减少这一有趣的现象,对这一现象的解释目前尚无文献报道,我们推测可能是由于晚期肝纤维化已处于相对稳定状态,胶原的合成与降解处新的平衡所致,有待于进一步研究。大鼠CCl4性肝纤维化8周,活化的HSC数量与NF-κBp65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达均呈显著正相关;13周活化的HSC数量也与NF-κBp65蛋白、TGF-β1mRNA的表达呈显著正相关;8、13周,护肝片组肝组织活化的HSC数量均较模型组显著减少,提示:①肝纤维化时HSC的活化、增殖与NF-κBp65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达有关;②护肝片的抗肝纤维化作用机制之一可能是抑制纤维化肝组织HSC的活化与增殖。目前共克隆得到5种TGF-β异构体,命名为TGF-β1-5,在哺乳动物仅有TGF-β1-3。在肝脏TGF-β1是各种TGF-β异构体中最主要的存在形式,TGF-β1含量较TGF-β2、TGF-β3高约10倍,TGF-β1是强有力的致纤维化的细胞因子,在肝纤维化时表达明显增多,促进HSC增殖活化,合成大量ECM,在纤维化进程中起重要作用。TGF-β1是肝纤维化主要的始动因子之一,研究证实肝纤维化时其表达增加。TGF-β产生时均以非活性状态存在,与相应受体无结合活性。肝受损时,肝内的炎症细胞、HSC、KC等自分泌或旁分泌非活性TGF-β1,非活性TGF-β1被炎症环境中的各种酶和细胞因子激活,刺激上述细胞进一步产生TGF-β1,形成逐级放大效应,导致TGF-β1大量生成和激活。活性TGF-β1通过与细胞膜上的受体结合而发挥作用,参与信号转导。TGF-β以自分泌和旁分泌方式参与HSC的活化,促进HSC合成各种胶原成分以及组织金属蛋白抑制剂(TIMPs),同时能够抑制基质金属蛋白酶(NMPs)的合成,引起ECM积聚而导致肝纤维化的发生。研究表明护肝片抑制纤维化大鼠肝组织TGF-β1及TβRⅠ的蛋白的表达,试验结果显示,在CCl4性大鼠肝纤维化中晚期,肝组织中TGF-β1及TβRⅠ的mRNA的表达均呈明显一致性增多,表明在肝纤维化过程中,TGF-β1及TβRⅠ表达增加是由于其转录水平增加所致,且TGF-β1与TβRⅠ在肝纤维化过程中有协同作用,在中晚期肝纤维化中起重要作用;模型组肝组织,TGF-β1mRNA的表达量13周显著高于8周,TβRⅠmRNA的表达量8周显著高于13周,护肝片在mRNA水平上抑制中晚期纤维化肝组织TGF-β1及TβRⅠ的表达,提示在肝纤维化不同时期,上述靶点的反应性有所差异,可能受到多种因素的影响,其机制有待进一步研究;抑制TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达是护肝片抗肝纤维化的作用靶点之一。TGF-β1的合成受核转录因子的调控,目前发现的核转录因子主要有NF-κB、AP-1等。NF-κB在哺乳动物中最多见的是由p65和p50组成的异源二聚体。细胞处于静息状态时,NF-κB位于细胞质,其p65亚基与抑制蛋白(InhibitorykappaB,IκB)单体结合,覆盖p50的核定位信号,使NF-κB与IκB以三聚体失活状态存在于细胞质中。当机体受到外界因素刺激时,IκB发生磷酸化,并从NF-κB二聚体上解离,暴露p50的核定位信号,NF-κB得以激活并移位进入细胞核促进靶基因转录。TGF-β1活化因子组织转谷氨酰酶(tTG)基因的启动子中含有NF-κB的结合位点,因而NF-κB能促进TGF-β1表达。本试验结果显示,与正常组相比,8、13周模型组大鼠肝脏组织NF-κBp65蛋白表达明显增强,而且8、13周NF-κBp65蛋白与TGF-β1及TβRⅠmRNA表达呈显著正相关,提示NF-κB参与肝纤维化反应,促进肝纤维化形成;肝纤维化过程中,N