猪A型塞内卡病毒分离鉴定

猪A型塞内卡病毒分离鉴定范围本文件规定了猪A型塞内卡病毒分离鉴定方法、RT-LAMP及RT-PCR诊断方法。本文件适用于猪A型塞内卡病毒的病原分离和鉴定、实验室诊断、病毒检测、流行病学调查。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法NY/T541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范缩略语下列缩略语适用于本文件。SVA：猪A型塞内卡病毒（曾用名：SVV）PBS：磷酸缓冲液DMEM：细胞营养液FBS：胎牛血清PK-15：猪肾细胞CPE：细胞病变DNAmarker：DNA相对分子质量标记HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸RT-LAMP：逆转录环介导等温扩增试剂与设备试剂与耗材所用生化试剂均为分析纯；实验用水应符合GB/T6682一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA相对分子质量标记（100bp~2000bp）、2×PCR混合液、1%的X脂糖凝胶、MgSO4、无水乙醇、BstDNA聚合酶、核酸染料、dNTPs、LAMPbuffer等；无菌移液器吸头、无菌眼科剪、一次性注射器、眼科镊、无菌离心管；PK-15细胞、DMEM培养基、胰蛋白酶、HEPES缓冲液（1mol/L储存液）、25cm2细胞培养瓶、0.22μm的一次性滤头、0.01mol/LpH7.0~7.4PBS（参见附录A）；4.1.6阳性对照：SVA（SVV-SC-01株）；阴性对照：PK-15细胞培养上清液；主要仪器设备微量移液器、组织破碎仪、组织研磨器、恒温水浴槽或恒温金属浴、离心机、二氧化碳恒温箱、通用型电泳仪、凝胶成像系统、荧光倒置显微镜、冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃）。样品的采集、保存与运输样品采集水泡液采集用一次性注射器吸取临床发病猪只水泡液0.5~1ml，并将水泡液装入保存管，加青霉素1000IU/mL、链霉素500IU/mL，加盖封口，-70℃冷冻保存。水泡皮采集用0.01mol/LPBS（pH7.4）清洗水泡表面，然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮，2~5g为宜。采集到的水泡皮，装入样品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，-70℃冷冻保存。组织样品采集若采集不到典型的水泡皮，则采集病灶周围破溃组织或淋巴结、肺脏、扁桃体、肠道等组织5~10g，装入样品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，-70℃冷冻保存。保存与运输采集的样品应按照《兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范》（NY/T541-2016）要求包装和运输。病毒的细胞分离培养样品的处理组织样品处理取0.5g待检组织样品，加入1ml的PBS缓冲液置组织均浆器中充分研磨（或采用传统液氮法研磨样本），反复冻融3次后，用含青、链霉素的DMEM作3∶1（V/W）稀释，3000r/min离心10min，取上清液，-70℃保存备用。或将充分研磨、反复冻融3次后的样本加PBS缓冲液作3：1（V/W）稀释后以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，-70℃保存备用。水泡液样品处理水泡液4℃3000r/min离心10min，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，-70℃保存备用。单层细胞制备在生物安全柜中操作，按常规方法将PK-15细胞或其他敏感细胞分装在25cm2细胞培养瓶中，每瓶加入含8%FBS的DMEM培养基5mL，细胞浓度应为2~3×105个/mL，37℃、5%CO2条件下培养48h。样品接种在生物安全柜中操作，取6.1中已处理好的上清液0.2ml接种到生长状况良好的单层PK-15细胞上（5ml工作体积）。每份样品接种2~4瓶细胞，另设细胞对照2~4瓶。37°C吸附1h，弃上清，加入5ml含2%FBS的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养48h。病毒收获每天观察记录CPE，若被检样品中有A型塞内卡病毒，通常在接种48h后可出现CPE，主要呈现细胞变圆，空泡增加，有死细胞漂浮在液面，最后溶解脱落。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。若出现CPE，将接毒细胞反复冻融三次，4℃3000r/min离心10min，收获病毒上清液，置-70℃保存，进行病毒核酸鉴定。若接种细胞第1代72h后未出现明显CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层细胞进行盲传，即1mL第一代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37℃培养。如此盲传3~5代，再进行鉴定。病毒核酸鉴定对6.4中收集到细胞/病毒液，或经6.1处理后的临床样品，选用RT-LAMP方法（逆转录环介导等温扩增法）和RT-PCR方法进行核酸鉴定。RT-PCR和RT-LAMP引物根据GenBank上已发表的SVA核酸序列（登录号：KY618836），选择编码VP1蛋白的序列作为RT-LAMP和RT-PCR的靶序列，运用PrimerExplorerV4软件设计一组RT-LAMP引物，包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP，使用Primer5软件设计引物（F/R）进行RT-PCR扩增，相关引物序列见表1。表1引物序列检测方法引物序列5′→3′位置bpRT-LAMPSVVF3CCGATCTCGACTACTGAATG2866～2886SVVB3GAGAACGCCACTGTCAGAC3017～3036SVVFIPCATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCC2881～2941SVVBIPTTCTAACACCCCGCCCAACA-TTGACGTACAGGCCGAAAC2953～3013RT-PCRSVVFTACAGTTTGGCCTGTTTCACT3063～3083SVVRCGCCCAGTAAAGTGGTAGGG3210～3229RNA的提取选择市售商品化RNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明书提取样品中的RNA。在提取RNA时，应设立阳性和阴性对照样品，按同样的方法提取RNA。RNA提取操作应在通风柜或生物安全柜中进行，避免RNA气溶胶的污染。反转录（cDNA的合成）配制反转录反应体系，使用商品化反转录试剂盒将7.2中提取的RNA反转录成cDNA，具体操作、体系参照说明书进行，cDNA于-20℃保存备用。RT-LAMP反应RT-LAMP反应体系反应体系中各组分见表2。表2RT-LAMP反应体系反应试剂总体系25µLBstDNA聚合酶缓冲液2.5µLRNA酶抑制剂（40U/μl）0.5µL反转录酶（200U/μl）0.75µLBstDNA聚合酶1µL甜菜碱（1mmol/l）2µLMgSO4（8mmol/l）2µL引物F3/B3（0.2μmol/l）各2µL引物FIP/BIP（1.6μmol/l）各4µLdNTPs（1.4mmol/L）2µLRNA模板（7.2中提取）1µLddH2O1.25µL其中BstDNA聚合酶缓冲液各组分为20mMTris-HCl（pH8.8），10mMKCl，10mM（NH4）2SO4，0.1%TritonX-100。RT-LAMP反应程序将7.4.1配制的反应体系置于65℃水浴或金属浴反应45min后，再置于80℃反应10min，产物4℃保存。RT-PCR反应RT-PCR反应体系反应体系见表3。表3RT-PCR反应体系PCR反应试剂总体积10µLµL2×TaqPCRmasterMix5上游引物：F（10µmol/L）0.5下游引物：R（10µmol/L）0.5cDNA模板（7.3中产物）1ddH2O（无菌水）3RT-PCR反应程序反应程序见表4。表4RT-PCR反应程序步骤时间和温度min、s/℃循环数个预变性5min/95℃1变性30s/95℃35退火30s/56℃延伸30s/72℃延伸7min/72℃1试验结果观察RT-LAMP显色反应在每个RT-LAMP反应管内加入荧光染料SYBRGreenI0.5μL，涡旋混匀，在紫外光下观察。X脂糖凝胶电泳成像PCR扩增结束后，取适量扩增产物加到1%的X脂糖凝胶加样孔中，并加入阳性、阴性对照和DNAmarker。使用电泳仪进行电泳，电压大小根据电泳槽长度确定，一般控制在4V/cm~6V/cm，电泳时间为10~20min。电泳结束后，将凝胶放在凝胶成像仪中观察记录成像结果。结果判定将RT-LAMP方法作为临床快速检测手段，最终分离鉴XX果需结合病毒分离和RT-PCR扩增测序结果进行综合判定。RT-LAMP成立条件对照成立，即电泳结果阴性对照无条带，阳性对照为1条梯状条带，且显色反应阴性对照管无变化，阳性对照管发出绿色荧光。阴性判定电泳结果未出现与阳性对照一致条带，显色反应样品管无绿色荧光变化，判定为：SVA核酸阴性。阳性判定电泳结果出现与阳性对照一致条带，且显色反应样品管发出绿色荧光，判定为：SVA核酸阳性。RT-PCR成立条件对照成立，即电泳结果阴性对照无条带，阳性对照出现1条167bp的DNA目的条带。阴性判定电泳结果未出现与阳性对照大小一致DNA条带，判定为：SVA核酸阴性。阳性判定电泳结果出现与阳性对照大小一致的DNA条带，判定为：SVA核酸阳性。对阳性扩增条带进行测序，并将测序结果与附录B.3序列比对，作为分离鉴定最终判定条件。病毒分离鉴定若细胞发生CPE，同时8.1或8.2结果为阳性，且测序比对结果正确，则判定为：SVA分离鉴定阳性若盲传3代后，细胞并未发生CPE，但8.1或8.2结果为阳性，则继续盲传至5代后，再进行RT-LAMP或RT-PCR核酸鉴定，若8.1或8.2结果仍为阳性，且测序比对结果正确，则判定为：SVA分离鉴定阳性，若8.1或8.2结果变为阴性，则判定为：SVA分离鉴定阴性。若盲传3代后，细胞并未发生CPE，且8.1或8.2结果为阴性，则判定为：SVA分离鉴定阴性。

（规范性附录）

试剂配制0.01mol/LpH7.0~7.4PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4∙12H2O3.58gKH2PO40.27g灭菌双蒸水800mLNaOH或者HCl调pH值7.0~7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL，121℃、15min高压锅灭菌冷却，置常温或4℃备用。电泳缓冲液TAE（50倍）三羟甲基甲烷碱（Trisbase）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸馏水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4℃冰箱中备用，如配制1%的X脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳缓冲液。1.0%X脂糖凝胶板制备X脂糖1.0g1×TAE缓冲液100mL0.5ug/mLGoldView5uL微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面。

（资料性附录）

猪A型塞内卡病毒简介猪A型塞内卡病毒简介A型塞内卡病毒（SenecavirusA，SVA）又称为塞尼卡谷病毒（Senecavalleyvirus，SVV），是一类无囊膜单股正链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科，塞内卡病毒属，是该属唯一成员。SVA基因组全长约7300nt，由一个6543nt的开放阅读框，668nt的5’端非编码区，68nt的3’端非编码区以poly（A）尾组成。SVA病毒粒子为二十面体结构，呈小型近圆形，直径约为17～25nm。SVA病毒基因组从头到尾依次为长的5’端非编码区，单一开放阅读框（openreadingframe，ORF），短的3’端非编码区。5’端非编码区包含基因组相关蛋白（VPg）序列和IV型核糖体内部进入位点（IRES），VPg蛋白以共价键与5’端非编码区连接，在病毒增殖过程中，可通过结合起始因子参与病毒RNA的翻译。IRES能招募核糖体对病毒RNA进行翻译，SVA的IRES在功能与结构上与经典猪瘟和乙型肝炎病毒的十分相似，这可能是由于持续感染的猪只中发生基因交换引起的。现已证实SVA感染猪能够引发原发性水泡病，引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水泡病变，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等临床表现。与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎引起的临床症状难以区分。自2015年以来，在美国、中国、泰国等多个国家暴发了SVA疫情，造成了严重的经济损失。SVA由于近些年才被发现，其临床症状类似于口蹄疫，使得感染猪只的上市存在重大的风险。对于SVA这样的猪场新病，全世界对其认知都比较有限，其对于猪场的短期和长期影响难以确切估计。SVA在巴西、美国和我国几乎同时发生，说明其从被发现至今，或有进一步扩大和爆发的可能，而作为新出现的疾病，其潜在影响是不可估量的，不得不引起足够的重视。且目前该病并无成熟的商业