鲟类志贺邻单胞菌病病原诊断技术规程

鲟类志贺邻单胞菌病病原诊断技术规程范围本标准规定了鲟类志贺邻单胞菌病诊断的术语和定义、试剂和材料、设备和器材、临床检查、实验室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。本标准适用于达氏鲟（Acipenserdabryanus）和西伯利亚鲟（Acipenserbaerii）的类志贺邻单胞菌的诊断。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品卫生微生物学检测染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T18652致病性嗜水气单胞菌检验方法SC/T7014水生动物检疫实验技术规范SC/T7013水生动物产地检疫采样技术规范SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术术语与定义下列术语和定义适用于本文件。鲟类志贺邻单胞菌病指由类志贺邻单胞菌（Plesiomonasshigelloides）感染引起达氏鲟和西伯利亚鲟发病或死亡的一种细菌性疾病。试剂和材料试剂、染色液和培养基检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照GB/T4789.28、GB/T18652和SC/T7014规定执行，Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg2+），DNA分子量标准参照物选用专业试剂公司提供的商品化试剂；微生物生化鉴定管可替代相应鉴定培养基或鉴定试剂，上述未提及的见附录A。水 应符合GB/T6682中一级水的规格。引物16SrRNA基因DNA序列扩增引物，P-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，-20℃保存。设备与器械超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、高速冷冻离心机、水平电泳系统、凝胶成像系统、普通光学显微镜、PCR扩增仪、电子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳丝、酒精灯等。临床检查临床症状病鱼反应迟钝，离群独游，游动迟缓或侧翻，摄食减少或停止摄食。体表检查病鱼鳍条基部不同程度的充血、出血；部分病鱼无明显外部病变而死亡。剖检胃肠道肠腔内有少量淡黄色的粘液；肝脏肿大充血，出血；部分病鱼肠道无明显的变化。实验室样品采集样品采集按SC/T7013执行。细菌分离与纯化在无菌的环境中，用灭菌铂耳分别勾取病鱼的肝、肾，划线接种至LB固体培养基，28℃培育24-48小时，从中挑取圆形、隆起、光滑、边缘整齐的单个菌落在LB平板上进行纯化培养。LB培养基的配制方法见附录A.1。细菌鉴定革兰氏染色按GB/T4789.28中2.2的规定执行。生理生化试验9.2.1葡萄糖利用试验按SC/T7201.1中的规定执行，培养基变黄色为阳性。9.2.2乙酰甲基甲醇（V-P）试验按SC/T7014中表2的规定执行。有气泡产生为阳性；无气泡产生为阴性。9.2.3氧化酶试验以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1%水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性，不变色为阴性。9.2.4吲哚试验按SC/T7014表2的吲哚（靛基质）试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为阴性。9.2.5糖、醇类（葡萄糖、甘露醇）发酵试验将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A.2），28℃培养24h后观察。培养基变黄色为阳性，不变黄色为阴性。16SrRNA基因序列测定与同源性分析9.3.1细菌基因组DNA抽提取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体。菌体悬浮于500μLTE缓冲液（pH8.0）（A.3），震荡悬浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.4），10μL20mg/mL的蛋白酶K（A.5），混匀，37℃温育1h。加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.6），充分混匀，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.7）混匀，65℃温育20min。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（A.8），混匀，12000r/min离心5min。取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（A.9），混匀，12000r/min离心5min。取上清液，加入1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，10000r/min离心10min；沉淀用70％酒精洗涤2次，室温晾干。加入50μL的TE缓冲液溶解，-20℃贮存，备用。9.3.216SrRNA基因扩增PCR反应体系：10×PCR缓冲液（无Mg2+）5.0μL，MgCl2（25mmol/L）5.0μL，dNTPs（10mmol/L）1.0μL，引物（20μmol/L）P-F和P-R各1.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，无菌双蒸水补足至50μL。混匀后，3000r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min；4℃保温。9.3.3X脂糖凝胶电泳用TAE电泳缓冲液（A.10）配制1％的X脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液（A.11）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约20-40min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察，并在长波紫外灯下用刀片切下含目的条带（约1500bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。9.3.4PCR扩增产物纯化、测序、序列比对9.3.4.1PCR扩增产物纯化9.3.4.1.1按每0.1gX脂糖凝胶加0.1mL酚，将酚加入9.3.3含有目的条带胶块的离心管中。9.3.4.1.2经漩涡震荡仪震荡1min-2min，将离心管在-70℃放置1h，使凝胶完全冻结。9.3.4.1.337℃水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡1min-2min；14000r/min离心5min。9.3.4.1.4取上层水相转入另一个离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25﹕24﹕1）（A.8），混匀，12000r/min离心5min。9.3.4.1.5取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（A.9），混匀，12000r/min离心5min。9.3.4.1.6向收集的水溶液中加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，置-20℃过夜或-70℃放置1h-2h。9.3.4.1.714000r/min离心10min，弃上清。9.3.4.1.8将沉淀的DNA溶于适当体积的TE缓冲液（A.3）中，置-20℃保存，待测。9.3.4.2PCR扩增产物测序与同源性分析将纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列（附录B）进行比对分析。10结果判定10.1菌落形态28℃培养18h-30h，形成圆形、隆起、光滑、边缘整齐的菌落。10.2细菌染色革兰氏染色为阴性短杆菌。10.3生理生化试验生理生化反应试验结果见表1表1类志贺邻单胞菌的生理生化反应结果反应项目结果反应项目结果反应项目结果氧化酶+甘露醇-V-P-吲哚+葡萄糖+注：“+”为阳性，“-”为阴性10.416SrRNA基因序列测定与同源性分析测定的16SrRNA基因序列与附录B所列的基因序列比较，同源性达98%以上。11综合判定符合以下所有特征者判定为类志贺邻单胞病a）临床症状与6相符；b）菌落形态和染色观察与10.1和10.2相符；c）生理生化反应结果与10.3相符；d）16SrRNA基因序列同源性分析结果与10.4相符；附录A（规范性附录）试剂配方A.1LB固体培养基胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5gX脂或者X脂糖15g蒸馏水1000mL，115℃灭菌20min。A.2糖、醇类发酵培养基蛋白胨2gNaCl5gK2HPO40.2g被测糖或醇类10gX脂6g溴百里酚蓝1％水溶液3mL（溴百里酚蓝先用少量95％乙醇溶解后，再加水配制1％的水溶液）蒸馏水1000mL，分装试管，培养基高度约4.5cm，115℃灭菌20min。A.3TE缓冲液（pH8.0）Tris碱（分子量121.1）0.121g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）0.0372g加入80mL双蒸水中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温保存。A.410％SDS溶液将10g十二烷基硫酸钠加入80mL双蒸水中，加热至68℃助溶，再加入双蒸水定容至100mL，室温保存。A.5蛋白酶K（20mg/mL）将蛋白酶K溶解于双蒸水中，至终浓度20mg/mL，分装入小管，置-20℃保存。A.65mol/L的NaCl溶液将29.22gNaCl（分子量58.44）溶解于80mL双蒸水中，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。A.7CTAB/NaCl溶液4.1gNaCl溶解于80mL双蒸水中，缓慢加入10gCTAB，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。A.8酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE缓冲液，4℃保存。A.9氯仿：异戊醇（24:1）将24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中。A.1050×TAE电泳缓冲液在400mL双蒸水中溶解121gTris碱，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加双蒸水定容至500mL，室温保存。使用时，配成1×TAE电泳缓冲液。A.11溴酚蓝指示剂溶液6×上样缓冲液将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。附录B（资料性附录）类志贺邻单胞菌16SrRNA基因参考序列（1415bp）AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCCGCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAAGTTGAGCTCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATGCCACTAGGTATTAACTAGTGACCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAG