植物绿叶挥发物的合成及调控机制研究进展

植物绿叶挥发物的合成及调控机制研究进展

植物生活在封闭的环境中，不能像动物那样移动自身的位置以避免外部环境的干扰和损害。为了适应环境并生存下来,植物在长期进化过程中进化出独特的多层次防御应答,通过多条信号途径激活机体防御应答体系,合成多样性的防御化合物以对抗病虫害和机械损伤、干旱、低温等不利的环境条件。这些防御化合物的合成过程,并非在所有植物中都能发生,而且不是维系植物生存所必需的,因此,这类化合物归为次生代谢物质。根据其存在状态,这些防御化合物可分为挥发性和非挥发性两大类。其中,非挥发性次生代谢产物如生物碱、萜类在植物直接防御应答中发挥作用,而挥发性有机化合物(volatileorganiccompounds)不仅参与植物的直接防御过程,在植物间接防御应答中亦发挥着重要的作用。绿叶挥发物(greenleafvolatiles,GLVs)是指植物产生的含6个碳原子的醛、醇及其酯,故又称C6挥发物。其名称源于叶片组织受挤压或昆虫啃食后植物散发出来的气味,所以有时英文也写为greennotecomponents、greenodour。近年来,由于绿叶挥发物有别于其他挥发性有机化合物的一些特征,如普遍存在于植物中、损伤后快速释放,该类挥发物在植物防御应答中的作用引起了越来越多研究者的关注。为了更好地理解这类化合物在植物防御应答中的作用并利用之,很有必要对该类化合物在植物中的研究进展进行归纳、总结。本文将以绿叶挥发物产生及对植物的生态生理作用为主,全面综述该类化合物的研究进展,以期为相关领域的研究人员提供参考。1c6醛的合成与释放采用合成途径关键酶基因突变体和酶活性抑制等方式,研究者对绿叶挥发物合成途径进行了研究,目前已基本阐明(Hatanakaetal.,1987;Salasetal.,2005;Matsui,2006)(图1)。该类化合物由十八碳烷酸途径(octadecadienoicacidpathway)氢过氧化物裂解酶(hydroperoxidelyase,HPL)分支途径而来。合成前体为亚油酸或亚麻酸,在II型脂肪氧合酶(lipoxygenase-2,LOX-2)作用下,在其13位发生加氧反应,生成的脂肪酸氢过氧化物(13-hydroperoxide,13-HPOT)随后被13-HPL裂解为C12化合物和C6醛(Hatanakaetal.,1987)。当合成前体为亚油酸(linoleicacid)时,产物为正己醛;当前体物质为亚麻酸(linolenicacid)时,产物为Z-3-己烯醛,经异构酶作用异构化为E-2-己烯醛,Z-3-己烯醛也可以异构化为E-3-己烯醛。这些挥发醛在乙醇还原酶的作用下还原为醇。E-3-己烯醛和正己醇乙酰化,形成Z-3-乙酸叶醇酯和乙酸己酯。此外,己烯醛双键衍生化,生成多于6个碳原子的绿叶挥发物,如4-羟基-E-2-己烯醛(Kohlmannetal.,1999)。此外,有些植物还会合成C5、C9挥发物,也属于绿叶挥发物。常见的绿叶挥发物组分及结构见图2。早在100多年前就有学者报道了绿叶组织中C6挥发醛的产生,但直到20世纪70年代,日本山口大学Hatanaka等学者才对该类化合物在植物中的产生与分布特征进行了较为系统的研究(Curtius&Franzen,1911;Hatanaka&Harada,1973;Hatanakaetal.,1976,1987)。Hatanaka和Harada(1973)从浸渍过的茶树(Theasinensis)叶片中提取得亚麻酸和Z-3-己烯醛,发现Z-3-己烯醛易于异构化为E-2-己烯醛。随后,该研究小组测定了不同季节茶树叶片中C6挥发醛和亚油酸及亚麻酸含量,发现E-2-己烯醛和Z-3-己烯醛开始合成于4月中旬,7月份合成量达到最高,进入秋季后这些物质的合成量逐渐下降,冬季(即第一年12月份到第二年3月份)几乎检测不到;Z-3-己烯醇含量在每年的5到10月份比较稳定;而亚油酸和亚麻酸含量除了在10月份出现一个高峰外,其他月份几乎保持不变。Hatanaka等(1987)通过分析不同植物C6醛合成与LOX、HPL酶活性和亚油酸、亚麻酸含量的关系发现:植物中普遍存在绿叶挥发物合成酶,但酶活性受植物种、环境温度、昼夜节律及日照强度等影响,变化幅度较大。Zhuang等(1992)以大豆(Glycinemax)为研究材料,发现C6醛合成量与叶片的发育阶段有关,幼叶合成量较高,且以正己醛为主;成熟叶合成量显著降低,且主要组分由正己醛转变为己烯醛。叶片发育过程中,亚麻酸和亚油酸变化趋势与己烯醛和正己醛类似。这些研究均采用机械或者冷冻损伤的方法测定叶片中绿叶挥发物含量,提示叶片中绿叶挥发物的组成和含量具有物种和生长发育阶段特异性。此外,高温、强光照、空气中高浓度的O3、氮素缺乏也可以诱导叶片C6挥发物的合成与释放(Hatanaka,1993;Beauchampetal.,2005;Loretoetal.,2006)。除叶片外,植物其他部位也可以合成绿叶挥发物,且合成量受组织器官发育阶段和温度、光周期等环境因子影响。如成熟期影响着花生果实中正己醛的合成,成熟早期检测不到该挥发物;成熟度不足的甜樱桃(Cerasusavium)冷藏期间E-2-己烯醛和正己醇含量减少,而2-甲基-丙醛和2-甲基-丁醛含量增加,说明成熟度和环境温度影响着果实中挥发醛的形成(Patteeetal.,1970;Serradillaetal.,2010)。成熟度同样影响着大豆种子绿叶挥发物组成与含量,成熟早期以E-2-己烯醛和正己醇为主,且含量随种子成熟而下降;成熟后期以正己醛和正己醇为主(Bouéetal.,2003)。储存温度的高低影响着番茄(Solanumlycopersicum)果实鲜榨物中绿叶挥发物合成量,储存温度升高,合成量增加,但正己醛例外;当环境温度低于24℃时,正己醛合成量随温度的升高而增加,但37℃时的合成量不及24℃时的合成量(Xu&Barringer,2009)。光照条件下生长的豆科灌木转移至黑暗条件下,枝条中绿叶挥发物合成与释放量增加,且释放量与光照生长期光合作用活性紧密相关,揭示绿叶挥发物的合成与释放受光周期调控(Jardineetal.,2012)。植物除了在上述正常生理条件下合成绿叶挥发物外,致病菌侵染、有益微生物定植以及植食性昆虫啃食也是导致绿叶挥发物合成与释放的重要环境生物因子。通过在菜豆(Phaseolusvulgaris)叶片接种假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.phaseolicola),Croft等(1993)发现无毒株接种叶片后,E-2-己烯醛和Z-3-己烯醇含量显著增加,而强毒株无此诱导活性。丛枝菌根真菌(arbuscularmycorrhizalfungi,AMF),一类广泛栖居于陆生植物根部的共生菌,不仅在植物营养物质摄取过程中发挥着积极作用,其感染亦促进了长叶车前(Plantagolanceolata)完整植株绿叶挥发物Z-3-乙酸叶醇酯的释放,释放量与机械损伤/草食性昆虫攻击引起的释放量相当(Fontanaetal.,2009)。Snoeren等(2010)通过分析植食性昆虫叮咬后不同生态型鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)的挥发物发现:不同生态型合成的绿叶挥发物组成与含量存在差别,提示植物遗传背景影响着绿叶挥发物的合成。关于根组织绿叶挥发物产生特征目前尚未见文献报道,但已有一些报道称药用植物黄芪根中存在着绿叶挥发物。2010版《中华人民共和国药典》规定:黄芪为豆科黄芪属膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus)或蒙古黄芪(A.membranaceusvar.mongolicus)的干燥根,属常用补益类中药,主产于我国黑龙江、甘肃、内蒙古、陕西、山西等地。徐怀德等(2011)研究发现,陕西产膜荚黄芪干、鲜药材中均含有正己醇、E-2-己烯醇、正己醛、E-2-己烯醛等绿叶挥发物;但鲜黄芪占有份额最大的是正己醇,E-2-己烯醇次之,再次为E-2-己烯醛,含量最低的是正己醛;而干黄芪中绿叶挥发物含量由高到低依次为:正己醛>正己醇>E-2-己烯醛。提示黄芪根生理状态影响着绿叶挥发物的组成和含量。黄芪干药材中正己醛含量的高低还与药材产地有关,道地产区——山西浑源产黄芪中正己醛含量远高于其他产地(Sunetal.,2010)。此外,黄芪药材中正己醛含量还与药材生长年限有关,道地产区5年生药材中含量最高;脂肪氧合酶活性变化规律与正己醛类似,5年生药材中活性最高(Xieetal.,2009)。综上所述,植物根、茎、叶、果实、种子均可以合成绿叶挥发物,但合成部位、组成和含量不仅与植物种及其生态型有关,还与组织器官所处发育阶段和生长季节等因素有关。此外,昼夜节律、气温、病虫害和有益菌定植等外界环境因素也影响着绿叶挥发物的合成与释放。这些研究对于揭示植物界绿叶挥发物多样化的形成与分布特征具有重要意义。但现有研究材料多为模式植物鼠耳芥和其他重要经济作物,药用植物中蕴藏着大量天然活性物质,但绿叶挥发物在药用植物中的产生特征尚未见文献报道。此外,植物根际栖居着大量的微生物且这些微生物的组成和比例随着植物生长发育和季节而变化,但根际微生物对绿叶挥发物产生的影响如何,很值得进一步进行探讨。2植物体内叶绿素中hpl的表达目前,涉及绿叶挥发物合成调控机制的研究较少,且现有研究多采用关键酶基因克隆与表达分析、酶活性分析等手段。如Vancanneyt等(2001)以马铃薯(Solanumtuberosum)为研究材料,分析了该合成途径关键酶HPL基因表达和酶活性,发现该基因表达与叶片发育阶段有关,幼嫩组织转录活性高且机械损伤诱导了该基因表达,但酶活性在不同发育阶段叶片及机械损伤前后几乎不变,揭示着绿叶挥发物合成的转录后调控机制。机械损伤、非致病性与致病性链格孢霉接种叶片后迅速诱导了柠檬(Citruslimon)幼苗叶片中RlemHPL的表达,茉莉酸合成途径关键酶——丙二烯氧化物合成酶(alleneoxidesynthase,AOS)基因表达量也迅速增加,但前者仅表达于叶片组织中,而AOS基因在根、茎、叶组织中均有表达;相比较而言,致病菌攻击对RlemHPL表达的影响较机械损伤大,对AOS基因表达的影响则与之相反;机械损伤和非致病性细菌接种并没有引起致病菌感染叶片中HPL活性升高,进一步证实了植物机体绿叶挥发物合成存在转录和转录后水平的调控(Gomietal.,2003)。Yan和Wang(2006)通过分析外源绿叶挥发醛和醇处理玉米(Zeamays)幼苗后释放的挥发物发现:完整植物吸收外源醛和醇后,将其转化为乙酰酯后释放出来,同时释放的还有萜类物质。Matsui等(2012)采用同位素示踪法,分析了鼠耳芥叶片损伤部位与其他部位的绿叶挥发物,结果发现持续存在于损伤部位的C6醛对损伤部位细胞发挥毒性作用多余的醛则通过还原作用,以醇与酯的形式存在于叶片未损伤部位。由于绿叶挥发醇和酯的细胞毒性较挥发醛弱,绿叶挥发物在植物体内的这种代谢方式可以确保未受损伤细胞存活下来。综上所述,已有研究揭示植物体内绿叶挥发物合成存在转录和转录后水平的调控,且外源诱导作用既与植物种、组织器官有关,也与应激源有关。绿叶挥发物体内代谢研究则指出,同一组织损伤部位向非损伤部位转运时存在挥发醛向醇或酯转化的现象。绿叶挥发物在植物体内特别是地上部分与地下部分是否存在转运过程,其特征如何,目前并不清楚。3叶绿素挥发物对植物基因组dna的作诱导作用对绿叶挥发物的最初认识源于其对植物特有气味如青草味、豆腥味等形成的贡献,现有研究已揭示出该类物质亦为植物防御应答体系的重要组成部分。20世纪80年代,Gueldner等(1985)通过比较玉米穗释放的挥发性物质E-2-己烯醛、2,4-己二烯醛、糖醛、芷香酮和壬醇体外抑制黄曲霉繁殖的作用,发现绿叶挥发物均具有抑菌活性;相比较而言,C6醛活性最强,C6醇活性最低。大豆中的相关研究进一步表明:该类挥发物均具有抑制多种真菌繁殖的作用,但抑菌活性与挥发物结构、浓度和真菌发育阶段有关,烯醛抑菌活性强于饱和醛(Gardneretal.,1990)。该类挥发物还具有抑制种子萌发和幼苗生长的作用。随后,多个研究小组的工作进一步肯定了该类挥发物的抑菌活性,且烯醛和烯醇的抑制作用强于饱和醛和饱和醇,常见绿叶挥发物中,E-3-己烯醛抑菌作用最强(Hamilton-Kempetal.,1992;Dengetal.,1993;Nakamura&Hatanaka,2002)。关于绿叶挥发物抑菌机理的研究较少,目前普遍认可的观点是这些挥发物与蛋白质中的氨基形成希夫氏碱结合物,引起蛋白质变性(Gardner,1979)。此外,4-oxo-2-己烯醛具有诱导实验动物组织DNA形成加合物,起着诱变剂的作用,但该类物质对植物基因组DNA的影响尚未见报道(Kasaietal.,2005)。除了上述抑菌活性外,绿叶挥发物还具有抑制蚜虫、螨虫和甲虫等繁殖的作用,且挥发醇的抑制作用强于挥发醛(Hildebrandetal.,1993;Hubertetal.,2006,2008a,2008b)。针对绿叶挥发物抑制昆虫繁殖的机理研究,仅有零星报道。如Dickens(1989)通过记录棉子象鼻虫触角嗅觉受体细胞对绿叶挥发物的应答,首次揭示出该昆虫嗅觉受体细胞中存在一组应答于该类挥发物的细胞群。毛虫啃食后释放出的绿叶挥发物还引导其天敌寄生蜂逆风飞向毛毛虫啃食植株,在昆虫-植物-天敌三者之间发挥互利素的作用(Whitman&Eller,1990)。蚜虫更倾向于啃食氢过氧化物酶缺失的马铃薯叶片,说明绿叶挥发物影响着蚜虫的摄食行为,发挥着信息素的作用(Vancanneytetal.,2001)。除了上述直接防御作用外,绿叶挥发物还是植物防御应答中的重要信号分子。如C6–C10烯醛具有诱导棉铃合成倍半萜类(如萘酚)、香豆素类(如东莨菪亭)植物抗毒素的作用,且损伤植物的合成量高于完整植株,但饱和醛无此活性(Zeringue,1992)。通过检测暴露于含绿叶挥发物的鼠耳芥幼苗防御相关基因表达与次生代谢产物积累,Bate和Rothstein(1998)发现绿叶挥发物具有诱导苯丙烷类代谢途径关键酶——苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)表达、促进花青苷积累的作用,对根的生长亦具有抑制作用,但作用强度较茉莉酸甲酯弱。此外,绿叶挥发物具有诱导LOX和AOS表达的作用,但对致病菌抗性相关基因(如蛋白酶抑制剂PR-1、PR-2)、甲羟戊酸途径关键酶——羟甲基戊二酸辅酶A还原酶(HMGR)表达无诱导作用。在柠檬中,E-2-己烯醛具有诱导RlemLOX、RlemHPL和AOS表达的作用,正己醛和正己醇对上述基因表达则起着抑制作用(Gomietal.,2003)。E-2-己烯醛、Z-3-己烯醛、Z-3-己烯醇具有诱导机械损伤/茉莉酸处理鼠耳芥防御应答基因表达的作用,主要包括查尔酮合成酶(chalconesynthase,CHS)、咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeicacid-O-methyltransferase,COMT)、谷胱甘肽硫转移酶(glutathioneS-transferase1,GST1)和LOX2,但基因表达水平与挥发物结构和剂量有关(Kishimotoetal.,2005)。绿叶挥发物在植物与植物间的交流中亦发挥着重要作用。禾本科植物水稻(Oryzasativa)中的研究表明:绿叶挥发物具有快速诱导完整植株合成茉莉酸类物质、促进挥发性倍半萜烯释放的作用,且邻近植物遭受过机械损伤或食草者攻击的植物诱导合成与释放量较邻近植物未受损伤者高,提示绿叶挥发物可以通过空气传播的方式增强植物诱导性防御应答,预置(priming)邻近植物防御应答体系(Engelberthetal.,2004)。玉米田间试验表明,绿叶挥发物具有预置挥发性倍半萜释放的作用,但不影响为害叶片的昆虫数量(vonMéreyetal.,2011)。绿叶挥发物预处理过的鼠耳芥较未处理者,茉莉酸甲酯处理后花青苷积累量显著增加,而绿叶挥发物本身对花青苷积累无影响(Hiraoetal.,2012)。为期3周的绿叶挥发物多次间歇微量释放(<6.167pmol·L–1)同样预置了邻近完整鼠耳芥植株的防御应答,成功地诱使赤眼蜂飞向绿叶挥发物感应植物,捕杀啃食者(Shiojirietal.,2012)。这些研究揭示着绿叶挥发物在植物防御应答中的预置作用,且预置作用具有微量累加效应。通过分析E-2-己烯醛和Z-3-己烯醛对不同信号途径突变体鼠耳芥中防御化合物camalexin积累的影响,Kishimoto等(2006)发现C6醛同时激活了乙烯、水杨酸、茉莉酸以及植物抗毒素信号途径,且对植物抗毒素信号途径的诱导作用最强。白粉虱啃食叶片后,水杨酸和茉莉酸信号途径防御相关基因表达水平增加,同时增强了植物地上部分和根对致病菌的抗性(Yietal.,2011)。总之,绿叶挥发物不仅具有直接抑制病虫害繁殖的作用,还具有诱导不同信号途径防御相关基因表达、促进防御化合物积累的作用,在植物防御应答体系中发挥着重要作用。现有研究亦揭示:绿叶挥发物生态生理作用不仅与其组分和浓度有关,还与植物种有关。但自然环境下,绿叶挥发物对植物不同防御应答信号途径、防御化合物合成以及植物根际微生物和内生菌的影响,目前尚未涉及。4道地产区药用植物中挥发性化合物的作用现代药学研究表明,许多植物药的药理活性与其所含的各类防御化合物有关,其中所含的生物碱类、黄酮类、皂苷类、萜类等化合物是众多中药疗效的物质基础,属植物次生代谢产物。这些物质是植物在长期进化过程中适应环境的结果,是植物自身用于减少昆虫或病原微生物危害、抵御不良环境的物质基础。对于特定植物而言,次生代谢产物的种类较为稳定,但含量与环境密切相关。就植物药而言,在我国古代有药材道地性之说,现代研究亦发现,不同产地的同种药用植物,其药理活性物质含量往往差异很大。道地药材是指在特定生态环境下所产生的药理活性成分含量高、临床疗效好的一类中药材。因此,道地药材在来源上具有强烈的地域性,特定的生态环境是中药材道地性形成的基础。特定的生态环境诱导了植物次生代谢合成途径关键酶基因的表达,进而促进了次生代谢产物的合成与积累。但在特定生态环境下,药用植物启动的防御应答不仅仅局限于药理活性物质,挥发性化合物必然也参与了植物的防御应答。特定生态环境因子作用“痕迹”