免疫组化和荧光课件

制白慧大家好！2021-3-211免疫组化图片

2021-3-212免疫荧光图片

2021-3-213免疫组化与免疫荧光免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反响使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素等)显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法；这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。2021-3-214实验原理免疫学的根本反响是抗原-抗体反响。由于抗原抗体反响具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反响时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反响使标记的显色剂显色来确定组织细胞内抗原；免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体〔或抗原〕上，与其相应的抗原〔或抗体〕结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反响。2021-3-215实验步骤脱蜡水化：二甲苯Ⅰ20min二甲苯Ⅱ20min无水乙醇Ⅰ10min无水乙醇Ⅱ10min95%乙醇5min80%乙醇5min75%乙醇5min50%乙醇过一遍蒸馏水过三遍高压修复4min流水冷却PBS冲洗5min×3次3%H2O215min，37℃/(0.5%Triton5min)PBS冲洗5min×3次10%山羊血清封闭37℃，50min一抗4℃,过夜复温37℃，1h

PBS冲洗5minx3次

二抗30min

PBS冲洗5minx3次

DAB显色＜1min/(DAPI5min)

PBS冲洗(盖片，观察。)苏木素复染1min自来水冲洗脱水，透明，封片。2021-3-216石蜡切片在染色过程中出现脱片现象

1〕烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

2〕用含有多聚赖氨酸的玻片；

3〕有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；

4〕用高温修复时，温度骤冷也可能引起。2021-3-219免疫组化常见问题的处理

标本无染色①确认是否忽略了应该加的某种试剂(一抗、二抗、三抗及底物等)。②确认所有的试剂是否按正确的顺序参加，是否孵育了足够的时间。③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配。④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应防止反复冻融，试剂保存时一定要防止与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。⑥检查标本的储存条件，最好用阳性的标本来同时做阳性对照。⑦检查冲洗液是否和反响试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。⑧检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。2021-3-2110弱阳性

①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最正确的使用浓度。④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。⑤孵育时切片是否放置水平，否那么会导致抗体流失。如果阴性对照没有反响，阳性对照反响良好，而标本弱阳性，那么可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。2021-3-2111产生组织切片非特异性染色

1〕抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。2〕一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，可试用单克隆抗体；

3〕内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高〔含血细胞多的组织〕，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4〕非特异性组分与抗体结合，通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5〕DAB孵育时间过长或浓度过高；

6〕PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗孵育之后的浸洗要充分；

7〕标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。2021-3-2112免疫荧光常见问题的处理非特异性染色产生原因及其解决方案：⑴游离荧光素残留在二抗中。购置高质量、高纯度的荧光素二抗。⑵抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。⑶组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原，可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。⑷从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。⑸抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。⑹荧光素不纯、标本固定不当等。⑺一抗和二抗孵育条件和浓度不适宜。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最正确。⑻一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。2021-3-2113阴性染色产生的原因有⑴一抗和二抗浓度不适宜或孵育条件不妥。⑵荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事项。⑶血清