乌梅白凤丸有效成分对mpp诱导小鼠黑质神经元凋亡的影响

乌梅白凤丸有效成分对mpp诱导小鼠黑质神经元凋亡的影响

帕金森病（parkinson’sdisease，pd）是一种退行性中枢神经系统疾病，也是老年人常见的疾病。55岁以上的人发病率约1%。PD最主要病理特征是中脑黑质致密带(SNc)DA能神经元进行性变性、脱失及伴发的纹状体轴突末梢DA耗竭,从而导致基底节神经调节功能的紊乱。PD的典型症状为静止震颤、肌肉僵硬、运动迟缓及姿势反射异常。目前由于PD的发病机制仍不清楚,遗传、环境、自由基、兴奋性氨基酸毒性作用、线粒体功能障碍等多种因素可能与PD的发生有关,而细胞凋亡可能是导致PD病人DA能神经元死亡的重要原因之一。因此,抗细胞凋亡可能会起到保护DA能神经元的作用。目前对于PD的治疗方案多是对症治疗,30多年来左旋多巴一直是做为首选药物,然而左旋多巴的长期应用也有明显的副作用,因此预防DA能神经元变性从而延缓PD的发生可能会成为一种替代治疗手段。乌鸡白凤丸有效成分(BFP)是一种广泛用于治疗妇科疾病的传统中药,并具有雌激素样作用活性,如降低血压、增加血管舒张度、减少血清三酰甘油、抗血小板活性以及刺激脑内DA释放等多种药理作用,但目前其药理方面的实验研究鲜有报道。本研究以C57BL小鼠为研究对象,用MPTP制备PD小鼠动物模型,观察BFP预处理对MPTP导致的黑质DA能神经元凋亡是否具有保护作用,并对其机制进行了初步探讨。1材料和方法1.1酪氨酸羟化酶C57BL小鼠由北京维通利华动物中心提供;BFP由香港中文大学生理系陈小章教授馈赠;酪氨酸羟化酶(TH)抗体、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)购自美国Sigma公司;TH免疫组化试剂盒、Bax抗血清、SABC试剂盒及DAB试剂盒由北京中山生物技术公司提供;高效液相色谱仪为美国Waters公司产品。1.2实验分组和治疗10~11周龄C57BL小鼠36只,雌雄各半,体质量(20±2)g,于20~24℃室温及相对湿度50%~60%昼夜循环光照条件下生活,自由饮水、取食,实验前适应实验室环境1周。随机分为3组:①MPTP组:每天9:00给予小鼠腹腔注射MPTP(30mg/kg),连用5d;②BFP+MPTP组:每天9:00小鼠口服喂食BFP(3g/kg),每天1次,连用14d,第15天给予小鼠口服喂食BFP(3g/kg),同时腹腔注射MPTP(30mg/kg),每天1次,持续到第19天;③正常对照组:口服喂食等体积生理盐水。于每次注射药物后均观察小鼠行为变化。1.3th免疫组织化学染色1.3.1穿刺缓冲液制备用80g/L水合氯醛将小鼠麻醉后,行主动脉插管,快速灌注150~200mL生理盐水冲洗血液,随即灌注300mL含40g/L多聚甲醛(4℃)的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB),先快后慢。然后断头取脑,置于同一固定液中4℃固定6h,再置入含250g/L蔗糖的PB液内4℃过夜或至脑组织块沉入瓶底。1.3.2冷冻切片将脑组织块于冠状黑质平面连续冷冻切片,片厚20μm。切片间隔分成2套,分别进行TH免疫组织化学染色和Bax免疫组织化学染色。1.3.3出现多次心理压力,加标回复突变1例切片置入含体积分数0.003H2O2的甲醛溶液中37℃孵育15min,以消除内源性过氧化物酶活性,0.01mol/LPBS(pH7.4)冲洗,共3次,每次5min;行抗原修复后滴加体积分数0.01的正常山羊血清,37℃孵育15min,吸去山羊血清,加一抗(1∶5000,用抗体稀释液稀释),于湿盒内4℃过夜;PBS冲洗,滴加生物素标记的二抗工作液,37℃孵育30min,PBS冲洗;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,37℃孵育30min,PBS冲洗,DAB显色10~15min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,最后镜下观察并照相。阳性细胞为细胞浆和突起着棕黄色。1.4bax免疫组织化学染色参照TH免疫组织化学染色方法,一抗为兔抗小鼠Bax(1∶200,用抗体稀释液稀释)多克隆抗体。阳性细胞为细胞浆着棕黄色。1.5视野内阳性细胞数和计数取SNc最明显处的3张切片,在密集阳性细胞中央部分取4个互不重叠的高倍视野(400倍),计数视野内阳性细胞数,顺序为自上而下,由左至右,不完全位于视野内的细胞不计数,最后把各视野内的细胞数相加后再取平均数。1.6在图案str中，da及其代谢产物二羟苯乙酸dopac和高香草酸hva的含量测定1.6.1流动相倍比weDA、DOPAC、HVA的标准溶液最后用流动相倍比稀释得6个浓度梯度:每20μL含16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5ng。1.6.2小鼠脑组织病理学检测在实验结束后,取正常对照组、MPTP组及BFP+MPTP组小鼠各6只,麻醉后断头取脑,于冰盒上分离并保留纹状体组织,保存于-70℃冰箱备用。1.6.3冰浴静置及b液制备将组织样品转入1.5mLEP管中,准确称量,加入冰冷的样品预处理A液100μL,冰浴中超声振动10s,冰浴静置1h后,4℃条件下,12000r/min离心20min,取80μL上清液转入另一支EP管中,加入40μL冰冷的预处理B液,涡旋混匀,冰浴静置1h,再于同一条件下离心20min,-70℃冷冻保存待测。1.6.4定性指标的测定设定样品流量1.0mL/min,ECD设定电压0.65V,每一样品检测35min。各标准品分别进样,检测其保留时间作为定性指标。将各标准品混合并稀释成6个浓度梯度,分别进样,检测并绘制标准曲线,求得直线回归方程。1.7统计处理实验结果以x¯±sx¯±s表示,应用SPSS10.0统计软件进行数据处理。2结果2.1bfp和mptp对小鼠血清th免疫阳性细胞的影响MPTP组小鼠在MPTP注射后数分钟可出现阵发性躯干震颤、竖毛、频繁的窜蹦及爬杆不能等短暂的行为反应,随后出现活动减少,随MPTP注射次数增加上述表现愈加严重,但次日略见恢复。给予BFP+MPTP组上述表现不明显。MPTP组SNc的TH免疫阳性细胞数量为(8.03±0.09),较正常对照组(21.17±0.85)减少,而BFP+MPTP组的TH免疫阳性细胞数量(17.29±1.69)较MPTP组明显增多。对染色结果的统计分析表明,MPTP组TH免疫阳性细胞数量较正常对照组明显降低(F=228.73,q=29.44,P<0.01);BFP+MPTP组的TH免疫阳性细胞数量与MPTP组相比明显升高(q=20.74,P<0.01)。2.2bfp和mptp对黑质神经元胞浆免疫阳性细胞计数结果分析Bax在胞浆内表达,为棕黄色颗粒状、丝状或条状物质。正常对照组黑质神经元Bax表达较少,细胞浆染色较浅,阳性细胞数目较少,为(14.73±1.47)个;MPTP组黑质神经元胞浆内棕黄色颗粒状、丝状或条状物质较多、较深,染色细胞数目增多,为(32.40±2.67)个;而BFP+MPTP组的染色细胞数目为(18.99±1.23)个。对染色结果的统计分析表明,MPTP组Bax免疫阳性细胞数量与正常对照组比较明显升高(F=35.56,q=22.31,P<0.01);而BFP+MPTP组的Bax免疫阳性细胞数量与MPTP组比较显著降低(q=16.93,P<0.01)。2.3差异显著性fMPTP组Str内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量降低,与正常对照组相比差异具有显著性(F=18.85~128.29,q=8.67~22.46,P<0.01)。BFP+MPTP组Str内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量比MPTP组升高,两者差别具有统计学意义(q=4.79~13.81,P<0.01)。见表1。3mptp对小鼠血清bax活性的影响PD是一种老年人常见的神经系统变性疾病,主要病理改变是SNcDA能神经元进行性变性缺失。在生化方面的改变,一般认为是TH的缺失导致Str内DA及其代谢产物含量的减低,从而引起一系列的症状。MPTP可引起SN-StrDA能神经元的变性,线粒体能量耗竭和氧化应激反应,是一种可用于诱导制备PD模型的神经毒性物质,可导致灵长类和小鼠SN-Str通路的DA能神经元变性,因此可模拟出PD的临床和病理特征,用MPTP制备的小鼠模型是国内外公认的最好的PD动物模型之一,已被广泛用于该病发病机制和治疗等研究。本研究给予C57BL小鼠皮下注射嗜神经毒素MPTP(30mg/kg)连续5d制成PD小鼠模型,采用HPLC法检测其Str内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量,发现MPTP组Str内DA及HVA含量明显下降,运用免疫组织化学染色法可观察到MPTP组SNcTH免疫阳性神经元数目与正常对照组相比明显减少,故可以判定此MPTP致小鼠PD模型造模成功。实验结果同时显示,经BFP预处理后,SNcDA能神经元脱失现象减少,凋亡细胞比例也明显减少,提示BFP有抗MPTP诱致黑质神经元凋亡的作用。Bax基因作为Bcl-2家族中调控细胞凋亡进程的代表基因之一,是近年来研究的热点。有研究显示,黑质内几乎所有的神经元,尤其是DA能神经元内含有大量的Bax蛋白,并在生长发育过程中调控着DA能神经元凋亡的进程。ZIV等用PC12细胞系研究发现,Bcl-2能明显抑制DA氧化及其氧化产物的生成,并且能阻止细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)水平下降。另有研究显示,Bcl-2过度表达的转基因小鼠可抵抗MPTP和6-0HDA对黑质DA能神经元的损害。此外,Bcl-2还可以通过其他途径,如影响细胞内Ca2+内流、阻止线粒体中细胞色素C的释放等发挥抗凋亡作用,而Bax蛋白则是通过与Bcl-2相关蛋白形成二聚体的形式来发挥作用,故能诱导细胞凋亡。HASSOUNA等发现小鼠注射MPTP后,其脑内黑质区BaxmRNA合成增加,呈现相应Bax免疫反应性的神经元都发生了死亡,说明MPTP毒性作用诱导Bax表达,其病理学意义是促进凋亡的发生。本文研究显示,MPTP可诱导黑质Bax蛋白表达水平增加,与以前研究结果相符;同时,BFP+MPTP组的黑质Bax蛋白表达降低,提示BFP阻断MPTP诱导的黑质神经元凋亡的可能的途径之一是通过减少Bax表达来发挥其抗细胞凋亡作用的,从而证实了BFP有效成分的作用机制与抗凋亡有关。由于PD的发病是多种致病因素如遗传、环境、年龄等共同作用的结果,其病因和发病机制尚未完全清楚。目前,PD的治疗主要是DA的替代疗法,即服用左旋多巴来弥补脑内DA不足,以改善临床症状,但这并不能阻止DA能神经元的继续凋亡,而且DA本身也可诱导神经元的凋亡,左旋多巴的这些副作用极大地限制了它的应用。近几年来,随着对PD发病机制研究的快速发展以及对细胞凋亡研究的深入,在对PD病人的实验