液相色谱串联质谱法测定人血浆中氯诺昔康的体内药代动力学研究

液相色谱串联质谱法测定人血浆中氯诺昔康的体内药代动力学研究

氯诺比妥是一种非体抗炎药物，具有强烈的抗炎性和镇痛作用，可用于急性疼痛（如急性腰痛、下背部疼痛和术后疼痛）或慢性炎症疼痛（如骨关节炎和类风湿性关节炎）。氯诺昔康与其他昔康类药物相比,明显的差异是其消除半衰期较短。有关生物样品中氯诺昔康的含量测定方法,文献报道均采用高效液相色谱法检测。本实验建立一种快速测定人血浆中氯诺昔康的液相色谱-质谱-质谱联用法,并用于氯诺昔康的临床药代动力学研究。baxwdb-c8柱仪器美国Finnigan公司TSQ型液相色谱-质谱-质谱联用仪,配有大气压化学离子化源(APCI)及Xcalibur1.1数据处理系统;美国Agilent公司HP1100自动进样器;日本岛津公司LC-10AD高效液相色谱输液泵;美国Zymark公司TurboVap蒸发仪。药品与试剂氯诺昔康对照品(含量99.5%),北京上地新世纪生物医药研究所提供;吡罗昔康对照品(内标,含量>99%),购自中国药品生物制品检定所;可塞风片(氯诺昔康片,奈科明奥地利有限公司生产,规格:8mg/片,批号:213464);空白人血浆由沈阳中心血站提供。色谱条件色谱柱为ZorbaxXDB-C8柱(150mm×4.6mmID,5μm,美国Agilent公司);流动相为甲醇-水-甲酸(80∶20∶0.5);流速0.7mL·min-1,柱温20℃。质谱条件离子源为大气压化学离子化源(APCI源),电晕放电电流为4.0μA,加热毛细管温度为250℃,气化室温度为450℃;鞘气(N2)流速768kPa,辅助气(N2)流量3L·min-1;正离子方式检测;扫描方式为选择反应监测(SRM);碰撞气(Ar)压力1.9Pa。碰撞诱导解离(CID)电压为25eV;用于定量分析的离子反应分别为m/z372→121(氯诺昔康)和m/z332→121(吡罗昔康)。扫描时间为0.3s。血浆样品处理取血浆0.5mL置于10mL具塞试管中,依次加入甲醇50μL,内标溶液(3.0mg·L-1吡罗昔康甲醇溶液)50μL和3mol·L-1磷酸100μL,混匀;加提取溶剂正己烷-二氯甲烷-异丙醇(300∶150∶15)3mL,涡流1min,振摇10min,离心5min,分取上层有机相于另一试管中,40℃空气流下吹干,残留物加200μL流动相溶解,涡流混合,取20μL进样。在药代动力学研究中的应用19名受试者于试验前一天20∶00开始禁食,试验当日7∶00空腹po氯诺昔康片1片(含氯诺昔康8mg),服药后2和5h进食统一的标准餐。采血期间禁烟酒和含咖啡因类饮料。于服药前和服药后0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,6.0,8.0,10.0,13.0和24.0h于前臂静脉取血4mL,移入经肝素处理的试管,离心,分离血浆,于-20℃保存至测定。达峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)为实测值,对药-时曲线进行对数线性回归求得消除速率常数(Ke),消除半衰期为T1/2=ln2/Ke,采用梯形法计算曲线下面积(AUC0-t和AUC0-∞)。CL=Dose/AUC0-∞,Vd=CL/Ke。结果1康和内标吡罗思想氯诺昔康和内标吡罗昔康在APCI离子化方式下,主要生成[M+H]+准分子离子峰,分别为m/z372和m/z332。选择准分子离子峰[M+H]+进行二级质谱分析(图1),氯诺昔康和内标吡罗昔康生成的主要碎片离子均为m/z121,将其作为定量分析时监测的产物离子。以该法获得的色谱图具有高度专属性。分别取6名受试者的空白血浆0.5mL,除不加内标外,按“血浆样品处理”项下依法操作,进样20μL,得色谱图,如图2A;将一定浓度的氯诺昔康标准溶液和内标加入空白血浆中,依同法操作,得色谱图,如图2B(a为氯诺昔康,b为内标)。氯诺昔康和内标吡罗昔康的保留时间约为2.8min。取受试者给药后的血浆样品,依同法操作,得色谱图,如图2C。结果表明,空白血浆中的内源性物质不干扰氯诺昔康和内标吡罗昔康的测定。2标准曲线的绘制取空白血浆0.5mL,加氯诺昔康标准系列溶液50μL,配制成相当于血浆浓度为2.0,5.0,15.0,50.0,100.0,200.0,500.0,1000和1600μg·L-1的样品,按“血浆样品处理”项下依法操作,建立标准曲线。以待测物浓度(X)为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值(Y)为纵坐标,用加权最小二乘法进行回归运算,求得的直线回归方程为:Y=2.34×10-4+2.075×10-3X,r2=0.9986。氯诺昔康的线性范围为2.0～1600.0μg·L-1,定量下限为2.0μg·L-1。3准确度与精密度取空白血浆0.5mL,按“标准曲线”项下制备氯诺昔康低、中、高3个浓度(分别为5.0,100.0和1000μg·L-1)的质量控制(QC)样品,6样本分析,连续测定3d,并与标准曲线同时进行,以当日的标准曲线计算QC样品的测得浓度,将结果进行方差分析,求得本法的准确度与精密度,数据见表1。数据表明该方法符合有关国际规范要求。4提取回收率按“标准曲线”项下的方法制备低、中、高3个浓度(分别为5.0,100.0和1000μg·L-1)的血浆样品;同时另取空白血浆0.5mL,按“血浆样品处理”项下操作,于上清液中加入相应浓度的标准溶液各50μL,涡流混合,40℃空气流下吹干。残留物以流动相溶解,进样分析。以每个浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。3种浓度下样品的提取回收率分别为72.8%,78.5%和72.6%。内标溶液经同样提取处理,其提取回收率为84.8%。本实验发现,氯诺昔康经提取后在室温放置12h稳定。5质控样品的整体取未知血浆样品测定时,每天建立一条标准曲线,同时分析低、中、高(双样本)的质控样品,根据当日标准曲线求算未知样品浓度和质控样品浓度,决定当日数据的取舍。对某些浓度超过定量上限的样品,用空白血浆稀释后进行复检。6血药浓度结果对19名中国男性健康受试者单剂量po氯诺昔康8mg后血药浓度进行了测定。其中1名受试者表现出异常的药动学行为,其Cmax为1.4mg·L-1,Tmax为2h,服药后24h血药浓度仍然很高(1.01mg·L-1),AUC0-∞为189.5mg·h·L-1,其消除半衰期达到了105h。图3给出了其他18名受试者po氯诺昔康8mg后,氯诺昔康的平均血浆浓度-时间曲线;主要药动学参数见表2。血浆药物的提取和测定方法氯诺昔康自人体内消除的速度,比已有的昔康类非甾体类抗炎药都快,有文献报道其在白人受试者体内的T1/2为3～5h,这就要求测定生物样品中氯诺昔康的浓度时,需要更宽的线性范围和更高的灵敏度。SuwaT等报道了同时测定人血浆中的氯诺昔康及其5′-羟基代谢物的HPLC-电化学检测法,用二氯甲烷分两次提取,当血浆用量为100μL时,氯诺昔康的定量限可达到5μg·L-1。该方法灵敏度较好,但是提取步骤较繁琐,并且加二氯甲烷提取后,有机相在下层,操作不便。另有文献报道采用HPLC-UV测定血浆和关节滑液中的氯诺昔康,实验中比较了两种提取方法,一种是采用Extrelut-1柱进行液-液萃取,当血浆用量为0.5mL时,定量下限为10μg·L-1;另一种是用C18柱进行固相萃取,可同时检测氯诺昔康及其5′-羟基代谢物。本文建立了一种简便而灵敏的液相色谱-质谱-质谱联用法,血浆样品用量较少,预处理过程简单,平均提取回收率较好且稳定,定量下限为2μg·L-1,已可满足测定的需要。LC/MS/MS技术具有高选择性:内标吡罗昔康和氯诺昔康有相近的保留时间和相同的碎片离子,氯诺昔康的离子反应为m/z372→121,吡罗昔康为m/z332→121,由于母离子不同,SRM可以同时对两个离子反应进行监测。在选定的色谱条件下,每个样品的色谱分析时间仅为3.3min,每天可分析100多个样品。该法灵敏度和线性范围均优于文献方法,适用于临床药代动力学研究。氯诺昔康进入人体后,在肝脏中受CYP2C9酶的催化生成5′-羟基氯诺昔康,是其主要代谢途径。由于缺乏5′-羟基氯诺昔康的对照品,作者无法对其进行定量。但本实验