动物转移因子的研究进展

动物转移因子的研究进展

转移因素（t）是存在于淋巴结和白细胞中的一种小分子物质。它可以将供体中的细胞免疫功能转移到受体，从而提高受体的免疫功能。TF属多肽类物质,含多种氨基酸,相对分子质量低,无热原,无抗原性,无毒副作用且无种属差异,是一种新型而又安全的免疫制剂。1949年由Lawrence首次发现。Lawrence发现结核菌素阳性供者的活淋巴细胞能使皮试阴性者转变为皮试阳性。以此为依据,Lawrence等1953年将其对应的白细胞可透析物质(DLE)重复实验后,发现DLE具备活淋巴细胞同样的功能,并把引起这种效应的物质称之为“转移因子”。20世纪70、80年代以来,随着细胞免疫学技术的发展,人们对转移因子的研究逐步深入,对动物转移因子的应用也进行了广泛的探索。目前,已了解了转移因子的基本成分、种属差异、特异性,建立了部分体内外检测方法,并正在积极探索将动物转移因子用于医学临床试验。美国已有部分品种的转移因子获准生产并用于动物疫病治疗。目前,用人、猪、牛、羊的白细胞、脾脏和淋巴结制备转移因子并用于临床的报道已经很多。本文就鸡转移因子的研制及其临床应用进行回顾和论述。1.制备方法和材料1.1超滤、纯化、分离鸡转移因子的制备方法主要采用透析-过柱法、超滤-过柱法或单纯透析法。曾仕廉等报道,将细胞置于-50℃冻结,再置于37℃水浴融化,如此反复冻融6次,4000r/min低温冷冻离心,上清液经中空纤维超滤器超滤,截留相对分子质量5000的超滤液,再采用SephadexG-25柱层析进行洗脱纯化。李富桂等报道,将组织置于组织捣碎机中粉碎匀浆后,用超声波裂解组织细胞,再于4000r/min离心20min。弃去沉淀,将上清液装入透析袋,搅拌透析48h,收集透析外液,蛋白质检测为阴性,再将透析外液用SephadexG-25柱层析进行洗脱纯化。江青艳等、日穆德玛等和马凤龙等报道,用无菌盐水洗净组织,在无菌条件下搅碎、称重,加1.5倍双蒸馏水制成匀浆,冻融9次,3000r/min离心30min,取上清液用透析袋进行透析,温度为4℃,磁力搅拌透析48h。1.2鸡脏器的原料鸡转移因子的制备材料以脾脏为主,也有报道用鸡胚细胞的。用鸡脾脏为原料的有粤黄鸡、乌鸡、来亨鸡、AA肉仔和AA成鸡脾脏;鸡胚细胞系采用鸡胚白细胞为原料制备鸡转移因子。2.鸡胚tf成分鸡转移因子透析液是呈无色或微黄的透明液体,而层析液为无色透明液体,略带腥膻气味。其pH值为6.7左右,用磺基水杨酸钠检测蛋白反应为阴性。鸡转移因子热原质检验和毒性检验均为阴性,对红细胞也没有任何毒害作用。A260/A280≥2.0。聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳结果鸡胚白细胞TF得到5条谱带。薄层色谱扫描鸡胚白细胞TF含有5个组分。鸡胚TF的红外吸收波数为3310cm-1、2974cm-1、1656cm-1、1544cm-1、1400cm-1和1083cm-1,鸡胚TF氨基酸组分为谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸等16种氨基酸;醋酸纤维素薄层电泳检测显示鸡胚TF含有RNA组分。粤黄鸡脾TF经SephadexG-25层析得到3个组分,紫外-可见光扫描光谱分析表明,透析外液及各组分的最大吸收峰值各不相同,与透析外液相比,组分Ⅰ和组分Ⅱ峰值右移,组分Ⅲ峰值左移,透析外液及各组分的A260/A280值也不相同,以组分Ⅲ最高,为10.05,组分Ⅱ次之,为5.25,透析外液为2.99,组分Ⅰ最低,为1.23,表明透析外液及各组分中核酸与多肽含量的比值:组分Ⅲ>组分Ⅱ>提取液>组分Ⅰ。氨基酸组分含有甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等17种氨基酸。李富桂等在研究AA肉鸡TF时报道,无论在260nm或是在280nm处均出现2个吸收峰。第1峰低且窄,第2峰高且宽,在匀浆时使用不同的溶液对波形具有一定的影响,这主要表现在第2峰到达顶峰的速度或是缓慢或是急速,从而波形陡峭或平缓。通过对层析各组分的紫外分析,TF完全集中在第2峰中。根据260nm和280nm处的吸收比值,对照层析所记录的波形分析,TF主要存在于峰值部分,且近似于正态分布曲线,即随着波形的上升,比值增大,到达顶峰后,波形下降比值也随之减少。匀浆时使用不同的溶液对TF在波形中的位置有影响,即偏于峰前或偏于峰后有所不同。多肽含量为0.1mg/ml。日穆德玛等报道,乌鸡脾转移因子多肽含量500μg/ml,核糖16.88μg/ml;来亨鸡脾转移因子多肽含量454μg/ml,核糖16.38μg/ml。乌鸡脾转移因子最高吸收峰值在波长250.5nm处。乌鸡脾转移因子经SepherdexG-25层析,分离得到6个组分,其中4、5峰较高,其A260/A280比值分别为2.14和2.83。用高效液相色谱进行核糖分析,在254nm处出现4个吸收峰,其中有2个峰值较高。3.tf对b细胞免疫作用转移因子具有很强的生物学活性。日穆德玛等和李相安等采用α-乙酸萘酯染色法观察T、B淋巴细胞,发现乌鸡TF可使乌鸡的T淋巴细胞明显增多(对照组和试验组的x¯±sx¯±s分别为14.70±5.65和23.55±9.47)。表明正常鸡体注射乌鸡TF后,对其细胞免疫功能具有明显增强作用,用3H-TdR掺入法抽测TF-H(正常人转移因子)和TF-BC(乌鸡脾细胞转移因子)对机体细胞免疫活性的影响,发现对照组和试验组差异有非常显著意义(F=14.935,P<0.01)。马凤龙等在鸡新城疫(ND)I系疫苗与TF联合应用的5次检测中,试验组的淋巴细胞转化率均高于对照组,差异有非常显著意义(P<0.01)。TF与ND-Lasota疫苗和法氏囊病(IBD)疫苗联合应用,明显提高体液免疫的效果,试验组的效价均高于对照组,两者差异有显著(P<0.05)或非常显著意义(P<0.01)。李富桂等用淋巴细胞转化实验法,以鸡喉气管炎(LT)病毒为刺激原检测鸡TF对T细胞的影响,发现48、72和96h后试验组的淋巴细胞转化率均高于对照组,差异有非常显著意义(P<0.01),说明鸡TF对细胞免疫效果具有增强作用。用血凝抑制实验法,以鸡减蛋综合征(EDS-76)病毒为刺激原检测鸡TF对B细胞的免疫效果,发现对照组与试验组的平均血凝抑制效价(log2χ)相差0.7个滴度,最高时相差1个滴度,数理统计结果差异有显著意义(P<0.05)。李相安等和江青艳等还证明鸡TF可促进免疫器官的发育,与对照组相比,口服鸡胚TF组免疫器官脾及法氏囊平均相对湿重(‰)分别高出0.114和0.046,差异有显著意义(P<0.01);注射给药组脾和法氏囊的相对湿重(‰)也分别高于对照组。王忠等证实鸡TF对小白鼠体重增长有促进作用。王建文等报道TF试验组与对照组相比,试验组鸡体重显著增加(12日龄时P<0.05,16日龄时P<0.01)。江青艳等用鸡TF给粤黄鸡注射,表明高、中浓度的TF对粤黄鸡的增重有明显的促进作用,同时可促进粤黄鸡的甲状腺素(T4)和生长激素(GH)分泌。4.在实践中的应用4.1tf的临床疗效和感染及对马立克氏病的疗效转移因子已广泛用于人及动物疾病的治疗,鸡TF在禽病的治疗方面也有不少报道。李富桂等报道TF对法氏囊病(IBD)具有治疗作用,试验组的治愈率为60%,卵抗治疗组为80%,对照组的存活率为20%;特别是当第二次感染IBD时,试验组表现出明显的优势。实验全部结束时,TF试验组的存活率为60%,卵抗治疗组为20%,对照组的存活率为20%,TF具有良好的疗效。对马立克氏病(MD)也表现出一定的疗效,在连续使用鸡转移因子8d后,瘫痪鸡全部站立,恢复行走,但第10天又重复发作。尽管还并不十分了解TF对MD的整个病理组织学的形态变化,但临床表现说明鸡TF对MD具有明显的抑制作用。王建文等报道鸡转移因子在一定程度上抑制和缓解急性实验性球虫病的临床症状,阻碍球虫病的发生和发展。黄建文等还报道,鸡TF对人工感染禽流感的雏鸡,能明显改善临床症状,减少死亡,缩短病程,可用于禽流感的早期治疗。4.2tf对鸡凝抑制作用TF不但可以用于疾病的治疗,而且可以用于疾病的预防,主要是与疫苗联合使用,加强疫苗的免疫作用。用鸡TF与鸡减蛋综合征疫苗联合使用,可明显提高其抗体效价,还可以使人工感染流感病毒的雏鸡较早产生血凝抑制抗体,且能快速达到较高水平。马凤龙等报道,鸡脾TF对新城疫IV系疫苗(ND-Lasota系)和传染性法氏囊病(IBD)疫苗的初免试验具有协同作用。试验组与对照组比较,其琼脂双扩散实验(AGP)的平均效价均高于对照组,差异有显著(P<0.05)或非常显著意义(P<0.01)。同时,试验组新城疫血凝抑制(ND-HI)的抗体效价也均高于对照组,差异有非常显著意义(P<0.01)。在ND-I系疫苗的加强免疫试验中,鸡脾TF无论是用作疫苗肌注,还是口服,对鸡ND-I系苗的免疫均有加强作用。试验组HI效价均高于对照组,差异有显著(P<0.05)或非常显著意义(P<0.01),但肌注组和口服组之间的HI效价差异无显著意义。在EDS-76灭活疫苗免疫试验中,鸡脾TF对鸡油乳剂灭活疫苗的免疫同样具有增强作用。试验组的HI效价均高于对照组,差异有显著意义(P<0.05)或非常显著意义(P<0.01)。日穆得玛等报道,乌鸡转移因子与鸡新城疫I系和鸡传染性支气管炎H120二联活疫苗联合使用时,对艾维茵肉仔鸡没有任何毒性作用,对细胞免疫具有活化作用,对血清γ-球蛋白无明显作用,但对艾维茵肉仔鸡生长具有一定的促进作用。日穆得玛等还报道,用乌鸡转移因子配合鸡新城疫疫苗不仅可以提高抗体效价,而且使疫苗抗体提前出现较高的水平,并能维持较长的时间。邵兵等的研究也得到了相同的结果。无论是预防或治疗,TF的主要使用途径有注射和口服两种,均表现出较好的效果。李富桂等证明,TF口服组作用快,