中药中农药残留检测方法的研究

中药中农药残留检测方法的研究

中药来自天然植物。随着世界环境的恶化，残余重金属和农药问题已成为影响其安全性的重要因素之一。残留重金属元素的毒性作用主要表现为慢性蓄积性中毒,它们与人体内酶蛋白上的-SH和-S-S-键牢固结合,从而使蛋白质变性,酶失去活性,组织细胞出现结构和功能上的损害。中药制剂中重金属可能来源于中药材,辅料,提取溶媒,设备及接触器皿等。农药对人体的危害主要表现为神经毒性:有机氯农药易产生慢性中毒;有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶有抑制作用,它们易产生急性中毒,有时严重危及生命;菊酯类农药对呼吸道可造成严重刺激,引起过敏性咳嗽及哮喘,对孕妇及儿童可引起类中毒反应。中药制剂中的农药残留主要原因是农药的不规范使用,也有些农药虽早已被禁用,但由于其不易分解,在土壤中长期残留,也会对中药材造成污染,中药材在仓储过程中为了防虫蛀而喷洒农药也可能成为重要的污染途径。近年来,中药中有害残留问题引起了越来越多的国内学者的关注,但有关中成药中农药残留量检测的研究报道较少。作者采用原子吸收分光光度法和原子荧光法测定了同仁乌鸡白凤丸中铅、镉、铜、砷、汞的含量,采用气相色谱法和气质联用法测定了其中9种有机氯、12种有机磷和3种拟除虫菊酯类农药的残留量,为其全面质量控制提供了实验依据。1试剂与标准品Mars5微波消解仪(CEM公司),AFS-9130双道原子荧光光度计(北京吉天仪器有限公司),SOLAARM6原子吸收光谱仪(Thermo公司),岛津GC2010气相色谱仪(带ECD检测器),岛津GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪,TraceGC气相色谱仪(带FPD检测器,Thermo公司),METTLERAE240电子天平,N-EVAP111氮吹仪,中华牌加热器(河南巩义市英峪仪器厂)。分析纯氯化钠、无水硫酸钠、硫酸、磷酸二氢铵、硝酸镁、碘化钾、抗坏血酸、盐酸羟胺、硼氢化钠、氢氧化钠、高锰酸钾、中性氧化铝(北京化学试剂公司),分析纯石油醚(60～90℃)、乙醚(北京化学试剂公司,重蒸馏后使用),优级纯硝酸、硫酸(北京化工厂),BV-Ⅲ级硝酸(北京化学试剂研究所),PR级正己烷、醋酸乙酯、丙酮、二氯甲烷(DIKMA公司),活性炭小柱(Supelclean公司),弗罗里硅土(PR级,60/100目,活化后含水2%,Alltech公司),柱色谱用微晶纤维素粉(Serva公司),水为超纯水。铅、镉、砷、汞、铜单元素标准溶液,α-BHC,PCNB,γ-BHC,β-BHC,δ-BHC,PP′-DDE,OP′-DDT,PP′-DDD,PP′-DDT,甲胺磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷、氧化乐果、久效磷、乐果、二嗪磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、对硫磷、杀扑磷、乙硫磷,氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯标准品均购自国家标准物质中心。同仁乌鸡白凤丸10批,由北京同仁堂股份有限公司北京同仁堂制药厂提供。2方法和结果2.1根据同益乌丰丸中重金属残留量的测定2.1.1标准储备溶液的制备将各单元素标准溶液用2%硝酸溶液稀释成一定浓度的标准贮备液,于低温保存,临用前稀释并制备标准曲线。2.1.2微波消解仪消解取同仁乌鸡白凤丸,研细,精密称取0.5g于聚四氟乙烯消解罐中,加硝酸5.00mL,混匀,盖好内盖,旋紧外套,置Mars5微波消解仪内按以下程序消解:第1步:温度3min内从室温升至110℃,保持3min;第2步:温度3min内从110℃升至150℃,保持3min;第3步:温度3min内从150℃升至180℃,保持9min。消解完毕后,使消解罐自然冷却至室温,置电热板上120℃加热至红棕色蒸气挥尽,并继续浓缩至约2～3mL,放冷,用水转移至25mL量瓶中,并稀释至刻度,即得供试品溶液。2.1.3标准曲线的绘制照《中国药典》2005年版一部附录ⅨB“砷、镉、铅、汞、铜测定法”分别测定了同仁乌鸡白凤丸中铅、镉、铜的含量,其标准曲线回归方程依次为Y=-0.000008X2+0.00351X+0.0040,r=0.9988;Y=-0.001947X2+0.05915X+0.0062,r=1.0000;Y=-0.009935X2+0.11778X+0.0006,r=0.9997,测定结果见表1。2.1.4测量汞的测定原子荧光法2.1.4.还原剂的制备检测波长253.6nm,空心阴极灯工作电流为60mA,以含0.2%硼氢化钠和0.2%氢氧化钠的混合溶液(临用前现配)作为还原剂,盐酸溶液(1～100)为载液,高纯氩为载气。2.1.4.盐酸羟胺溶液配制精密量取汞标准储备液(100ng·mL-1)1mL,置100mL量瓶中,加20%硫酸溶液20mL,5%高锰酸钾溶液0.5mL,摇匀,滴加5%盐酸羟胺溶液至紫红色恰好消失,加水稀释至刻度,摇匀。仪器自动配置标准曲线,浓度分别为0,0.1,0.3,0.5,0.7,1.0ng·mL-1,测定荧光强度,以荧光值为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,其回归方程为Y=0.0034X+0.0070,r=0.9997。2.1.4.盐酸羟胺溶液精密量取供试品溶液2mL,置10mL比色管中,加20%硫酸2mL,5%高锰酸钾溶液0.1mL,摇匀,滴加5%盐酸羟胺溶液至紫红色恰好消失,加水稀释至刻度,摇匀。照标准曲线的制备项下方法测定荧光值,从标准曲线上读出供试品中汞的含量,计算,即得,结果见表1。2.1.5测定硫逆光的测定原子灯光法2.1.5.还原剂溶液配制检测波长193.7nm,空心阴极灯工作电流为60mA,以含1%硼氢化钠和0.3%氢氧化钠的混合溶液作为还原剂,盐酸溶液(1～100)为载液,高纯氩为载气。2.1.5.对照品溶液的制备精密量取砷标准储备液(1μg·mL-1)5mL,用2%硝酸溶液稀释至100mL。精密量取5mL,加25%碘化钾溶液(临用前现配)1mL,摇匀,加10%抗坏血酸溶液(临用前现配)1mL,摇匀,用盐酸溶液(20～100)稀释至25mL,摇匀,作为对照品溶液(10ng·mL-1)。仪器自动配置标准曲线,质量浓度分别为0,1,3,5,7,10ng·mL-1,测定荧光强度值,以荧光值为纵坐标,质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,其回归方程为Y=0.0162X+0.2807,r=0.9978。2.1.5.样品含量测定精密量取供试品溶液5mL,照标准曲线的制备项下,自“加25%碘化钾溶液1mL起”,依法测定,从标准曲线上读出供试品中砷的含量,计算,即得,结果见表1。2.2结果表明，乌丰丸中有机氯农药残留量2.2.1ecd设备进样EQYUTY-1701弹性石英毛细管柱(0.25μm×0.25mm×30m),柱升温程序:初始温度60℃,以60℃·min-1升至180℃,再以5℃·min-1升至210℃,保持10min,以15℃·min-1升至250℃,保持5min,进样口温度220℃,不分流进样,ECD检测器温度300℃,载气高纯氮,柱流速1.48mL·min-1,吹扫气流速3mL·min-1,进样量1.0μL。有机氯对照标准品色谱图见图1。2.2.2标准品溶液的测定结果取同仁乌鸡白凤丸,研细,精密称取2g,照《中国药典》2005年版一部附录ⅨQ“农药残留量测定法”测定了9种有机氯类农药残留量,结果部分样品中检出α-BHC,β-BHC,δ-BHC,PP′-DDE,其余有机氯类农药均未检出,标准品标准曲线的回归方程和测定结果分别见表2,3。为保证含量测定的可靠性,随行制备了加样回收样品,取供试品2g,精密加入200ng·mL-1的混合标准品溶液1mL,同法测定,各标准品回收率见表2。2.3结果表明，乌丰丸中含有机磷农药残留量2.3.1fpd设备进样RESTEKRtx-5弹性石英毛细管柱(0.25μm×0.25mm×30m),柱升温程序:初始温度60℃,以30℃·min-1升至120℃,再以5℃·min-1升至130℃,保持3min,以15℃·min-1升至180℃,保持5min,以15℃·min-1升至270℃,保持4min,进样口温度250℃,不分流进样,FPD检测器温度120℃,载气高纯氮,柱流速1.50mL·min-1,氢气流速90mL·min-1,空气流速115mL·min-1,进样量1.0μL。有机磷混合对照品色谱图见图2。2.3.2标准品的测定取同仁乌鸡白凤丸,研细,精密称取3g,照《中国药典》2005年版一部附录ⅨQ“农药残留量测定法”测定了12种有机磷类农药残留量,结果10批样品中均未检出有机磷类农药,标准品标准曲线的回归方程见表4。为保证含量测定的可靠性,随行制备了加样回收样品,取供试品3g,精密加入浓度为1μg·mL-1的混合标准品溶液0.5mL,同法测定。2.4同一恒优白凤丸中，拟消除菊酯类农药残留2.4.1氯氰菊酯检测色谱条件:DB-5弹性石英毛细管柱(0.25μm×0.25mm×30m),柱升温程序:初始温度60℃,以30℃·min-1升至120℃,再以10℃·min-1升至200℃,以2℃·min-1升至230℃,以30℃·min-1升至280℃,保持7min,进样口温度250℃,不分流进样,载气高纯氦,柱流速1.40mL·min-1,进样量1.0μL。质谱条件:负化学电离离子源(NCI),电压1.0kV,温度200℃,选择离子(SIM)模式监测:29.00～30.00min,选择碎片离子207(定量离子),171(定性离子),对氯氰菊酯进行检测;30.00～31.50min,选择碎片离子211(定量离子),167(定性离子),对氰戊菊酯进行检测;31.50～33.20min,选择碎片离子79(定量离子),137(定性离子),对溴氰菊酯进行检测,混合标准品的选择离子扫描质谱图见图3。2.4.2标准曲线的绘制分别精密称取氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯对照品适量,加醋酸乙酯配制成1μg·mL-1的混合标准品储备液,精密移取混合对照品储备液适量,加醋酸乙酯逐步稀释成1,10,50,100,200ng·mL-1的混合对照品溶液,按上述色谱条件进样,每个浓度进样3次,以质量浓度X为横坐标,平均峰面积值Y为纵坐标绘制标准曲线,各标准品回归方程见表5。2.4.3样品测定和样品测定取同仁乌鸡白凤丸,研细,精密称取2g,照《中国药典》2005年版一部附录ⅨQ“农药残留量测定法”下“拟除虫菊酯类农药残留测定”项下方法制得供试品,按上述色谱条件进样测定,部分样品中检出氯氰菊酯,其余拟除虫菊酯类农药均未检出,结果批号4030271,5035022,5035023的3批样品中氯氰菊酯残留量0.005,0.008,0.004mg·kg-1。为考察含量测定的准确性,随行制备了加样回收样品,各标准品回收率见表5。3样品的制备和加样回收率的测定中国、FAO/WHO、欧盟对药材(或草药)中本实验涉及的重金属及农药残留限量的规定与10批样品测定结果的最大值的比较见表6,由表可知,所测样品中重金属含量均未超过《中国药典》的限量要求,而农药残留量均未超过《中国药典》和欧洲药典的限量要求,因《中国药典》仅对少数农药规定了限量,建议以《中国药典》和欧洲药典的限量为参考分别对同仁乌鸡白凤丸中重金属和农药残留量进行控制。经比较实验,三步消解比一步消解效果好,故采用三步操作制备重金属测定用供试品。另经考察发现,在120℃酸性环境中加热浓缩,砷、汞无损失。汞的原子荧光测定中加入5%高锰酸钾将样品中各种形式的汞氧化成同价态的汞,再与活泼态氢生成氢化汞,汞化氢进一步被氢离子还原成原子态汞进入吸收池测定。5%盐酸羟胺的作用是还原过剩的高锰酸钾。原子荧光法测砷时加入25%碘化钾将溶液中的各种高价态的砷还原为同价态的砷,然后与活泼态氢生成氢化砷,进一步生成原子态砷用于测定。碘化钾被氧化后生成的碘用10%抗坏血酸还原,同时,抗坏血酸对干扰金属离子也起到一定的掩蔽作用。因农药残留测定属痕量检测,环境、试剂和样品中的其他成分均易造成干扰,所以应随行加样回收实验,以确保结果的可靠性。对于农药残留测定,随行回收率可接受的范围是60%～140%,本实验中用于测定拟除虫菊酯类农药随行回收率的溶液进样前放置过久,可能导致被测成分分解,造成实验回收率低。因农药残留的测定为痕量检测,为排除假阳性结果,采用另一极性的色谱柱对有机氯残留测定结果进行验证。色谱条件为:DB-5弹性石英毛细管柱(0.25μm×0.25mm×30m),柱升温程序:初始温度120℃,以30℃·min-1升至180℃,再以5℃·min-1升至210℃,保持10min,以15℃·min-