乌梅低聚肽的结构及抗氧化活性研究

乌梅低聚肽的结构及抗氧化活性研究

乌江又名乌骨鸡，是中国特有的鸡种。它具有特殊的营养价值，是优良的蛋白质来源。乌鸡低聚肽是以乌鸡蛋白为原料,经过酶解后获得的低分子量肽产物。目前研究认为,肠道内只存在二肽和三肽的运输系统,对多肽的大规模运输很少。低聚肽吸收速度快、耗能低,易于被人体消化、吸收和利用,并且具有降血压、抗氧化、抗疲劳、免疫调节等重要的生理活性。目前,关于乌鸡多肽抗氧化活性的研究有一些报道,但其分子量大多为1000~5000u,分子量较大,而对乌鸡低聚肽的抗氧化作用鲜见报道。本文在对乌鸡低聚肽进行基础理化性质、分子量分布和氨基酸组成分析基础上,从多个方面对其抗氧化活性进行了评价。1材料和方法1.1材料和机器1.1.1合成其他氨基甲烷乌鸡低聚肽,北京中食海氏生物技术有限公司提供;抗坏血酸(Vc)、水杨酸钠、铁氰化钾,广东汕头市西陇化工有限公司,分析纯;代苦味酰基(DPPH),美国Sigma公司,色谱纯;三羟甲基氨基甲烷(Tris),美国Sigma公司,超纯;三氯乙酸、邻苯三酚,国药集团化学试剂有限公司,分析纯。1.1.2北京热浴锅设备UV22100紫外可见分光光度计,尤尼柯上海仪器有限公司;GSY-Ⅱ电热恒温水浴锅,北京市医疗设备厂;QSY-Ⅱ型凯式定氮仪,北京强盛分析仪器制造中心;LC-20A高效液相色谱仪,日本SHIMADZU公司;835-50型氨基酸分析仪,日本日立公司;LG10-2.4A型高速离心机,北京医用离心机厂。1.2方法1.2.1物理和化学性质总蛋白质含量测定:采用凯氏定氮法;酸溶蛋白质含量测定:采用三氯乙酸法;灰分含量测定:采用灼烧法;水分含量测定:采用常压干燥法。1.2.2相对分子质量校正曲线采用高效液相凝胶色谱法。将样品溶解于流动相,过膜后用高效液相色谱仪进行凝胶过滤,紫外检测器进行检测,然后使用GPC软件对色谱数据进行处理,以肽标准品做相对分子质量校正曲线。肽标准品为:乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451)、杆菌酶(分子量1450)、细胞色素C(分子量12500)。色谱条件为:色谱柱:TSKgelG2000SWXL300×7.8mm;流动相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;检测波长:220nm;流速:0.5mL/min;柱温:30℃;进样体积:10μL。1.2.3氨基酸自动分析方法参照GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法,采用氨基酸自动分析仪进行分析。对色氨酸的检测采用碱水解法,用5mol/LNaOH水解,其余氨基酸以6mol/LHCL水解测定。1.2.4抗氧化酶ai的测定在5mL具塞试管中分别加入1.5mL样品溶液及1.5mL0.1mmol/LDPPH溶液,摇匀,避光反应30min后,在517nm下测定其吸光度Ai,同时测定1.5mL0.1mmol/LDPPH溶液与1.5mL95%乙醇混合液的吸光度A0,以及1.5mL样品溶液与1.5mL95%乙醇混合液的吸光度Aj。清除率计算公式为:S/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×1001.2.5清除水杨酸钠-乙醇溶液中吸光度的测定采用Sminoff的水杨酸钠方法,并略有改动。在10mL具塞试管中分别加入2.3mmmol/LFeSO4溶液1mL,2.3mmmol/L水杨酸钠-乙醇溶液1mL,样品溶液0.5mL,最后加入1mL2.2mmmol/LH2O2溶液启动反应,37℃下反应1h,于510nm下测定吸光值。清除率计算公式为:S/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100式中:A0,不加样品的吸光度值;Ai,加入样品的吸光度值;Aj,无显色剂时样品的本底值。1.2.6邻苯三酚自氧化时反应速率的测定采用邻苯三酚自氧化法。在10mL具塞试管中分别加入50mmol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2)4.5mL,去离子水4.1mL,25℃水浴中保温20min后,立即加入样品溶液0.1mL,25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚0.3mL,于325nm下每隔30s测定吸光度。抑制率计算公式为:R/%=(△A1/△t-△A2/△t)/△A1/△t×100式中:△A1/△t,邻苯三酚自氧化时反应速率;△A2/△t,加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率。1.2.7磷酸盐缓冲溶液ph值采用Oyaizu法,并略有改动。在10mL具塞试管中分别加入样品溶液2mL,0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)2mL,质量分数1%铁氰化钾2mL,50℃水浴中保温20min后,加入质量分数10%三氯乙酸2mL。取2mL反应液,分别加入2mL去离子水和0.4mL质量分数0.1%FeCl3溶液,反应10min后,于700nm下测定吸光值。2结果与讨论2.1中小分子蛋白质含量乌鸡低聚肽中总蛋白质和酸溶蛋白质含量很高,分别为84.15%和83.13%,其中酸溶蛋白质占总蛋白质的98.79%,可见乌鸡低聚肽中小分子蛋白质含量较高。灰分和水分含量分别为6.65%和4.00%。2.2鸡低聚肽的种类及含量所得分子量标准曲线方程为:logMW=6.914367-0.203034t,R2=0.999。由表1可知,乌鸡低聚肽大多为1000u以下,高达96.74%,其中含量最高的是140~500u的小肽,占78.53%,主要是二肽、三肽(表1)。研究表明,肽的生物活性与分子量大小有关,能在体内起活性作用的肽大多是1000u以下的小肽。2.3氨基酸及衍生物氨基酸含量测定结果(见表2)表明,乌鸡低聚肽中必需氨基酸和半必需氨基酸(组氨酸和精氨酸)含量分别为31.21%和7.67%,占总氨基酸含量的44.84%。谷氨酸含量最高,其次是天门冬氨酸、赖氨酸,这些氨基酸对于调节人体生理机能具有重要的意义。对肽类而言,其氨基酸组成与抗氧化活性具有明显的相关性。研究表明,许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力,如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸等。乌鸡低聚肽富含抗氧化性氨基酸,其中赖氨酸、亮氨酸和精氨酸含量较高。2.4低聚肽对dpph自由基清除率的影响DPPH法是评价天然抗氧化剂清除自由基能力的一种快速可行的方法。由图2可见,在所选浓度范围内,乌鸡低聚肽对DPPH自由基清除率呈上升趋势,高浓度时上升趋势减缓,可能是因为低聚肽已趋于饱和,其IC50值约为4.5mg/mL,可见,乌鸡低聚肽具有较强的DPPH自由基清除能力。Vc作为一种高效抗氧化剂,具有极强的DPPH自由基清除能力,IC50值约为4.2μg/mL。2.5清除oh的能力羟基自由基(·OH)是毒性最大的自由基,可作用于脂质、核酸、蛋白质等有机物大分子。水杨酸钠法是检测抗氧化剂对·OH清除能力常用的方法。图3显示的分别是乌鸡低聚肽和Vc对·OH的清除作用。在所选浓度范围内,乌鸡低聚肽对·OH的清除作用不断增强,高浓度时上升趋势减缓,9mg/mL时,清除率达到92.90%。乌鸡低聚肽和Vc的IC50值分别约为4.5mg/mL和0.62mg/mL,可见与Vc相比,乌鸡低聚肽清除·OH能力相对较弱。2.6乌苏叶低聚肽对邻苯三酚的清除作用超氧阴离子自由基(O-2·)是所有氧自由基中的第一个自由基,可以经过一系列反应产生其他氧自由基,因此是评价物质抗氧化能力的一个重要指标。由图4可见,乌鸡低聚肽能明显降低邻苯三酚自氧化的速率,具有一定的O-2·清除能力,并且呈现很好的量效关系,其IC50值约为12mg/mL。Vc对O-2·的清除能力要强一些,其IC50值约为0.032mg/mL。由实验结果可知,乌鸡低聚肽清除O-2·的能力比·OH差一些,这可能因为·OH具有极强的氧化能力,能将所有的有机质氧化,从而显示出更高的抗氧化能力。2.7还原能力的测定吸光值越大,还原能力越强,抗氧化能力就越强。因此,还原能力是检验抗氧化活力的一个重要指标。由图5可知,乌鸡低聚肽的吸光值随着浓度的增加而增大,浓度为9.19mg/mL时的还原能力与0.02mg/mL的Vc相当,可见乌鸡低聚肽具有一定的还原能力。乌鸡低聚肽在低浓度时的还原能力较低,吸光值基本没有变化,罗文峰等对乌鸡多肽的研究也证明了这一点。3鸡低聚肽小肽抗氧化活性测定在对乌鸡低聚肽进行成分分析的基础上,通过测定乌鸡低聚肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力和还原能力,对其体外抗氧化性进行了全面的评价。结果表明,乌鸡低聚肽中小分子蛋白质含量较高,分子量大多为1