挥发性脂肪酸和乳酸的测定

挥发性脂肪酸和乳酸的测定

发酸脂肪酸（vf）和硫酸是饲料沉淀过程中的主要产物。其中，醋酸和醋酸可以有效降低环境的ph值，抑制不耐酸分解的腐败菌的生长，丙酸钠可以抑制细菌的繁殖，丁酸钠与青驻扎饲料的腐败有关。因此，其含量和组成比例可反映出青驻扎饲料的质量和质量优良。这是评估青储备质量的重要指标。有机酸的分析方法有比色法、滴定法、色谱法等。相比之下，气相色谱法以快速、准确、简便，能同时测定多个组分而被广泛应用，但气相色谱法也受多种条件的影响，如色谱条件、样品的处理方法等。目前报道的同时测定VFAs和乳酸的气相色谱法中，除色谱条件差别很大外，主要以外标法为主，且乳酸需要进行复杂费时的前处理。外标法虽然简单、方便，但受进样量和载气量的影响较大，精密度也不高，在气相色谱定量分析中还是以内标法更理想。为此，本试验选用巴豆酸为内标物，探讨无需任何前处理便能同时测定VFAs和乳酸含量的最佳色谱条件。1材料和方法1.1色谱标准岛津2010型气相色谱仪、氢火焰离子化检测器（FID）、HP-INNOWAX(19091N-133）毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）、微量注射器（10μL）、高纯氢气（99.99%）、高纯氮气（99.99%）、钢瓶空气、乙酸、丙酸和丁酸的色谱纯标准溶液（国药）、DL-乳酸（生工）、巴豆酸（国药）。1.2检测室温度柱温采用程序升温方法，初始温度120℃，采用10℃/min的速率升温至220℃，保持2min。气化室温度250℃，检测室温度270℃。载气使用高纯氮气，总压力为160kPa，总流量为80.7mL/min，柱流量1.89mL/min，线速度44.7cm/s，分流比40∶1，吹扫流量3.0mL/min，循环流量30.0mL/min,H2流量40mL/min，空气流量400mL/min。1.3溶液制备1.3.1标准溶液1.3.2标准系列溶液的制备量取乙、丙、丁酸的色谱纯标准品和乳酸的分析纯适量，分别加入6μL1mol/L的内标溶液，以超纯水稀释至1mL，制成乙、丙、丁酸浓度分别为2、4、6、8、10mmol/L，乳酸浓度均为12、24、36、48、60mmol/L的标准系列溶液。1.3.3对照品溶液的配制分别取乙、丙、丁酸的色谱纯标准品和乳酸分析纯各适量，加入定量的内标溶液，用高纯水稀释至1mL后，摇匀，配成3种不同浓度的对照品溶液，见表1。1.3.4待测溶液配制分别取乙、丙、丁酸的色谱纯标准品和乳酸分析纯各适量，加入定量的内标溶液，用高纯水稀释至1mL后，摇匀，配出表2中不同浓度组分的待测溶液。1.4偏磷酸+巴豆酸溶液的制备取剪碎的青贮玉米70g(W）于具塞三角瓶中，加入150mL的蒸馏水后，放入4℃冰箱内浸取24h，期间每隔6h均匀摇晃三角瓶5min，以保证浸取完全。浸取完毕后进行过滤，将提取物用80目涤纶筛网过滤液挤尽，通过定量滤纸过滤于500mL(V）的容量瓶中定容、摇匀。取提取液5mL(V1）于10mL离心管中并分别加入1mL25%的偏磷酸和1mL42mmol/L的巴豆酸（保证内标物浓度一致），振荡、静置30min后离心10min，取上清液用于上机分析。青贮饲料鲜样中各种有机酸的总量可按下式计算：其中，P%为内标标准曲线上各组分的含量。2结果与分析2.1色度分析的条件选择2.1.1毛细管柱的选择乙、丙、丁和乳酸均为强极性物质，故应选择与之极性相似的毛细管柱，这样各组分之间容易分开，峰重叠现象较少，峰形较好。本试验根据实验室情况，选择以聚乙二醇为固定相的HP-INNOWAX(19091N-133）毛细管柱。2.1.2程序升温速率柱温通常有2种选择方式：一种为恒温分析，另一种为程序升温。有研究报道，程序升温分析在分离效果和灵敏度两方面都明显优于恒温分析，而色谱定量的准确性和可靠性主要取决于色谱峰分离的好坏，因此，本试验采用柱温程序升温，初始温度120℃，终止温度220℃，并保持2min。随着升温速率的增加，测定组分的出峰时间缩短，但不同组分之间的分离则越来越困难。当程序升温速率由8℃/min升至12℃/min，对VFAs出峰时间的改变很微小，但对乳酸的出峰时间变化较明显（如图1）。鉴于保证各组分的分离效果，将程序升温的速率设定为10℃/min（如图2）。2.1.3乳酸的出峰时间升温速率固定在10℃/min，载气压力分别为130、140、150、160、170kPa和180kPa时进样测定出峰时间和效果。载气压力与出峰时间的关系如图3，当载气由130kPa升至180kPa时，乳酸的出峰时间有所缩短，其余组分变化微小。试验结果显示，出峰时间会随载气压力的增加而缩短，但压力过大会导致各组分分离不完全，压力过小则会延长分析时间，由此可选择既节省载气消耗又能缩短每个样品的分析时间的最佳结合点（即160kPa），实现经济高效的原则。2.2乳酸浓度的确定为横坐标，各酸组分与内标物的峰面积比（Y）为纵坐标，建立标准曲线，进行回归计算，得到回归方程：Y乙=2.3042X+0.0318,R=0.9986;Y丙=1.4397X-0.0281,R=0.9928;Y丁=1.1441X-0.0602,R=0.9971;Y乳=2.6108X+1.7726,R=0.9907。由以上方程可知，乙、丙、丁酸浓度在2～10mmol/L时，乳酸浓度在12～60mmol/L时，线性关系良好。同时，通过气相色谱仪可得本方法乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的最小检测浓度分别为0.127、0.087、0.075mmol/L和0.665mmol/L。2.3测定校正因子取配制好的对照品溶液A、B、C，分别按照选择好的色谱条件进行测定，进样2μL，每个溶液平行进样3次，计算校正因子，并求平均数：式中，As为内标物质的峰面积，Ai为对照品的峰面积，Cs为内标物质溶液的浓度，Ci为对照品溶液的浓度。2.4回收率和标准偏差取待测溶液A、B，按2.2中方法测定乙、丙、丁、乳酸的含量，重复10次，由相对校正因子计算其回收率和相对标准偏差。从表3中可知，2种不同浓度待测液中乙、丙、丁、乳酸的回收率均在95%以上，相对标准偏差为0.44%～1.88%，精确度和可信度均较高。2.5精密度和准确度为了提高本方法的实际应用性，试验也选取青贮玉米鲜样进行测定。取制备好的样品上清液及加入标品后溶液上机分析，分别重复测定10次，其精密度及回收率见表4。结果显示，此方法中青贮料样品的回收率也达到93%以上，但比待测标液要低一点，而相对标准偏差虽然控制在2.46%以下，重复性却没有待测标液的好，可能是因为青贮玉米没有经过衍生化处理，含有的杂质对结果有一定影响。3衍生化处理后样品的测定本试验采用毛细管柱气相色谱仪，通过对柱温升温程序、载气压力及气化室、检测室温度等一系列色谱条件进行探究，建立了无需任何预处理同时测定挥发性脂肪酸和乳酸的方法。目前报道的有机酸测定方法中，样品大都要经过非常复杂的酯化预处理或加酸酸化后才能进样。常影等对乳酸进行衍生化处理后测定其含量，回收率为96.15%～108.27%，相对偏差为0.84%～4.07%；林秋萍等利用高碘酸将乳酸氧化为乙醛后进样，回收率在78.2%～95.6%之间，标准偏差高达7.9%。本试验采用的方法无需对乳酸进行预处理，标准液和青贮玉米的回收率分别在95.63%～98.97%、93.71%～97.54%，两者的相对偏差也控制在较低水平，均好于上述两种测定，这证明此方法在实际测定青贮料的品质时是方便可行的，也是非常实用的。另外