二维振动光谱的普适性

二维振动光谱的普适性

一、背景介绍1.维相关技术理论的发展二维相关光谱的基本概念最早起源于30年前的原子能发生器（nmr）领域。二维核磁谱是通过多脉冲技术激发核自旋,采集时间域上原子核自旋弛豫过程的衰减信号,经双傅里叶变换得到的。其显著的特点是:将光谱信号扩展到第二维上以提高光谱分辨率,简化含有许多重叠峰的复杂光谱;通过选择相关的光谱信号鉴别和研究分子内和分子间的相互作用。各种二维核磁共振技术(2DNMR)在核磁共振光谱学家的努力下已建立起来并得到了广泛的应用。但是使人感到奇怪的是,尽管二维光谱在核磁领域蓬勃发展,但二维相关技术却一直没能深入其他的光谱分支,如红外、拉曼、紫外、荧光等。阻碍二维技术发展的一个重要原因是普通光谱的时间标尺(timescale)要比核磁的时间标尺短得多。举例来说,红外吸收光谱观察的分子振动时间标尺在皮秒数量级,而核磁中时间标尺数量级一般在毫秒到微秒间。因此基于多重射频脉冲励磁技术的二维核磁技术可以成功地在精密而昂贵的核磁仪器上实现,却不能在普通的红外、拉曼和紫外等仪器上实现。1986年,Noda就二维NMR技术的理论提出了一个概念性的突破,他把磁实验中的多重射频励磁看作是一种对体系的外部扰动。以这种全新的视角简化看待二维核磁技术,就可以轻易地设计出完全不同的二维光谱实验技术。为此,1989年Noda提出一项新的实验方案,用一个低频率的扰动作用在样品上,通过测定比振动弛豫慢许多,但与分子尺寸运动紧密相关的不同弛豫过程的红外振动光谱,将数学相关分析技术用于红外光谱中得到二维红外相关光谱图。这些慢的弛豫过程可以用现有的普通红外光谱仪,通过简单的时间分辨技术加以研究。于是,最初的二维红外相关光谱技术的理论就此诞生。然而最初的二维红外相关光谱技术的理论中,外扰的波形仅局限于正弦波形。这就极大地限制了二维相关技术在普通光谱上的进一步发展。1993年,Noda再次对已有理论进行修正,破除了外扰波形的局限,并且用Hilbert转换替代了原先二维相关分析中的Fourier转换,由此缩短了二维处理的时间,并把新的理论正式命名为“广义二维相关光谱技术”。至此,应用的外扰的波形可以多种多样,从简单的正弦波、一串脉冲,到随机的噪音或静态的物理变化,均可应用于外扰。如电场、热、磁、化学、机械,甚至声波等变化。每种外扰对体系的影响是独特而有选择性的,由特定的宏观刺激和微观或分子级别的相互作用机理决定。此后,这种二维相关分析技术开始逐渐适用于拉曼、荧光、X射线衍射、GPC等其它谱学技术中。2.维相关函数二维相关光谱的基本想法实际非常简单。就是考虑由外扰引起的外扰变量t在Tmin和Tmax间变化时光谱强度y(ν,t)的变化。体系对外扰的反应经常表现为有特征的光谱变化,称作动态光谱(dynamicspectrum)。因此,二维相关实际上测的就是动态光谱的变化。外扰变量t经常被当作时间,但它也可以是任意其它合理的物理变量,如温度、压强、浓度、电压等。光学变量ν可以是任何合适的光谱量化系数,如拉曼位移、红外或近红外波数、紫外波长,甚至是X光散射角。体系受外扰引起的动态光谱ˉyy¯(ν,t)可以正式定义为:ˉy(ν,t)={y(ν,t)-ˉy(ν)Τmin≤t≤Τmax0otherwise(1)y¯(ν,t)={y(ν,t)−y¯(ν)0Tmin≤t≤Tmaxotherwise(1)ˉyy¯(ν)是体系的参比光谱。参比光谱的选择并不一定要严格一致,在大多数情况下,我们使用光谱的平均值,定义为:ˉy(ν)=1Τmax-Τmin∫ΤmaxΤminy(ν,t)dt(2)y¯(ν)=1Tmax−Tmin∫TmaxTminy(ν,t)dt(2)在某些应用中,我们可以通过选择在某个参考点(t=Tref)观察到的光谱作为参考光谱。参考点可以选择实验的初始状态,即在施以外扰前的足够长的时间(Tref→-∞),或是在实验开始时(Tref=Tmin),或是在实验结束时(Tref=Tmax),甚至是在体系完全不受外扰影响的时候(Tref→+∞)。当然参比光谱也可以简单地设为零,这样动态光谱就和我们观察到的光谱强度完全一致了。二维相关强度X(ν1,ν2)代表在一定外部变化t的区间内,对不同光学变量ν1和ν2的光学强度变化˜yy˜(ν1,t)的函数进行比较。由于相关函数是计算两个互不依赖的光学变量ν1和ν2光学强度的变化,因此我们可以将X(ν1,ν2)转变为复数形式:X(ν1,ν2)=Φ(ν1‚ν2)+iΨ(ν1,ν2)(3)X(ν1,ν2)=Φ(ν1‚ν2)+iΨ(ν1,ν2)(3)组成复数的相互垂直的实部和虚部分别被称作同步和异步二维相关强度。同步二维相关强度Φ(ν1,ν2)表示随着t值的变化,两个在不同光学变量下测量的互不依赖的光学强度的相似性变化。恰恰相反,异步二维相关强度Ψ(ν1,ν2)表示光学强度的相异性变化。广义二维相关函数及其定义的同步和异步相关强度如下:X(ν1,ν2)=1π(Τmax-Τmin)∫∞0˜Y1(ω)⋅˜Y*2(ω)dω(4)˜Y1(ω)=∫∞-∞˜y(ν1,t)e-iωtdt(5)˜Y*2(ω)=∫∞-∞˜y(ν2,t)e+iωtdt(6)X(ν1,ν2)=1π(Tmax−Tmin)∫∞0Y˜1(ω)⋅Y˜∗2(ω)dω(4)Y˜1(ω)=∫∞−∞y˜(ν1,t)e−iωtdt(5)Y˜∗2(ω)=∫∞−∞y˜(ν2,t)e+iωtdt(6)˜YY˜(ω)是光强˜yy˜(ν,t)经傅立叶变换得到,傅立叶频率ω代表˜yy˜(ν,t)随外扰t变化的个体频率。由于二维相关光强的计算过程必须描绘二维光谱中的每一点,即使使用快速傅立叶算法的计算步骤来按照公式(4)计算广义二维相关光谱,数据也会多得难以想像,所以我们在计算过程中应用了适当的估算。我们在外扰t变化区间Tmin和Tmax内等间隔地选取m个动态光谱,Δt=(Tmax-Tmin)/(m-1),同步二维相关强度可以简单地表示为:˜yj(νi)是外扰tj点的光学强度。˜yj(νi)=˜y(νi,tj)i=1,2(8)如果光谱系列并不是在外扰t上等间隔选取的,那么我们就必须进行一定调整。比如我们可以通过内插等方法使本来不均匀的光谱系列变得均匀。同步光谱就按照这个新的系列由公式(7)给出。异步二维相关光强的计算就更加困难。有许多估算方法可以对异步光谱进行合理的估算,然而最简单有效的估算方法由下式给出:其中Njk代表Hilbert-Noda转变矩阵的第j行第k列的元素,表示为:Νjk={0j=k1/π(k-j)otherwise(10)3.维相关谱图图1所示为基于外扰的二维相关光谱实验的基本流程:对一个想要研究的体系施加一个特定的外扰,由此得到这个体系的一系列动态光谱;然后对这一系列动态光谱进行二维相关分析,得到最后的二维相关光谱。二维相关光谱谱图最常见的表示形式就是二维contourmap,如图2所示。其中2(A)和2(B)分别是同步相关谱和异步相关谱,分别介绍如下。(1)同步谱的表现在特定外扰t作用下,ν1、ν2代表的不同官能团振动如果同时取向,就会在二维谱上产生相应的同步相关峰Φ(ν1,ν2)。这种分子微观结构运动的同步性表明基团之间有很强的协同作用或可能存在强烈的相互作用。图2(A)显示了一个典型的同步二维相关谱的强度变化等高线图。同步二维相关谱是关于对角线对称的(即相应光谱的相同波数坐标ν1=ν2),相关峰可以出现在对角线上或对角线之外。在对角线上出现的强度峰相当于光谱强度变化在观察的周期T当中的自相关函数值,这类峰称为自相关峰(auto-peak)。自相关峰强度总为正值(正峰用空白表示,负峰用阴影表示),其大小代表了在相关周期中光谱强度动态涨落的总程度。因此,只要光学变量ν在外扰Tmin和Tmax区间内出现显著的变化,同步谱中就会出现相应的自相关峰Φ(ν,ν)。图2(A)中在波数A、B、C、D处都出现了自相关峰,说明这4个峰在观察的区间内,强度发生了显著变化。位于对角线以外的相关峰称为交叉峰(crosspeak),代表的就是不同波数上光谱信号的同步变化。图2(A)中A和C,B和D分别同步相关,A和C形成负交叉峰,而B和D形成正交叉峰。在外扰t作用下,两个基团受激发偶极矩取向方向相同,无论是平行于或垂直于外部扰动方向,同步交叉峰为正值;而如果两个基团受激发偶极矩取向方向互相垂直,则交叉峰为负值。简单来说,如果光谱强度在相应的波数上同时增大或减小,相应交叉峰为正,如果一个光谱强度增大的同时另一个光谱强度反而减小,相应交叉峰为负。但需要强调的是相关分析是一个数学方法,它不能区分不相关的协同过程。因此没有同步交叉峰表示没有化学偶联或相互作用,但是有同步交叉峰并不说明有化学偶联或相互作用,仅证明两者间对外部扰动有协同响应。(2)维相关谱特性图2(B)显示的是一个异步二维相关谱的强度变化等高线图。异步光谱表示的是在ν1和ν2处光强连续的、继承的变化。与同步光谱不同的是,异步光谱在对角线两侧是反对称的。异步相关谱没有自相关峰,只有交叉峰Ψ(ν1,ν2),交叉峰也有正负之别。从图中发现A、B、C、D4个波数之间分别出现A和B、A和D、B和C、C和D4个交叉峰。异步交叉峰仅当两个动态光谱强度变化,彼此之间信号涨落的傅里叶频率成分不同相位时才出现。这种特性在区分由不同光谱来源或不同组分形成的重叠峰时特别有用。判断两吸收峰相关关系的规则如下:①如果Φ(ν1,ν2)>0,在ν1>ν2区域,正异步交叉峰(Ψ(ν1,ν2)>0)说明光谱强度变化在高波数ν1处先于ν2处发生;负异步交叉峰(Ψ(ν1,ν2)<0)说明光谱强度变化在高波数ν1处晚于ν2处发生。②如果Φ(ν1,ν2)<0,以上规则相反。③如果只有同步相关峰Φ(ν1,ν2),而异步相关交叉峰强度消失,即Ψ(ν1,ν2)=0,说明两个基团受激发偶极矩的取向同时发生;④如果同步相关光谱中的相应同步相关强度消失,即Φ(ν1,ν2)=0,则两个基团受激发偶极矩的取向关系不能确定。除了二维contourmap的表示形式,二维相关的结果还能以fishnetrepresentation,一种3D渔网图表达(图3)。虽然fishnet的形式可以更方便地比较各个二维相关峰的强度,但却无法清晰定位相关峰的波数,因此contourmap的形式还是更为常用。总的来说,二维振动光谱相对于一维振动谱有两大显著优势:①二维光谱因为将光谱信号扩张到第二维上,因此具有较高的分辨率,可以区分出在一维光谱上被覆盖的小峰和弱峰;②通过对同步交叉峰和异步交叉峰的仔细分析,可以判断出各个基团相对于特定外扰的一个运动顺序,这点在研究体系分子间或分子内的结构和构象的变化方面显得尤为重要。二、使用二维相关光谱的示例1.同谱三维技术(1)水的弯曲振动例子:2DATRFTIR光谱研究水在间规聚丙烯中的扩散机理最近有很多研究关注水在聚合物中的扩散行为[22,23,24,25,26,27,28,29]。这是因为越来越多的聚合物材料被广泛应用在各个领域,而水是一种最常用的扩散剂。例如,聚丙烯取代玻璃制品越来越多地被应用到各种包装材料,这是因为聚丙烯是一种高疏水性材料,透水率相对于其他高分子材料来说比较低。然而即使是极其少量的水也能引起内部材料性质的变化,所以研究水在聚丙烯膜中的扩散机理是非常有必要的。图4是典型的水和s-PP混合物的红外谱图。通常研究的是水的伸缩振动区域,因为水的弯曲振动峰强度弱,又经常被其他峰覆盖,所以很少有研究水的弯曲振动区域。而在PP体系中,水的弯曲振动区域并没有和PP本身的吸收区域相冲突,我们发现图4中虽然水的弯曲振动的强度不是很大,但是峰却相对来说非常独立,所以我们想对PP中水的弯曲振动区域(图5)进行研究。图5是渗透过程中,ATR晶体检测到的一系列不同时间段下的水和s-PP混合物的红外谱图。经过二维相关分析,二维异步谱图列于图6。图中出现的两个相关峰Ψ(1676/1645cm-1),Ψ(1645/1592cm-1)说明一共有3种形态的水分子扩散进PP网络,其出峰位置分别在1676、1645、1592cm-1。和水的伸缩振动不同,在水的弯曲振动区域,随着氢键的增强,O—H弯曲振动峰位发生蓝移。因此,我们可以认定这3种形态的水中,1676cm-1是指相互间氢键最强的结合水;1645cm-1是指氢键相对来说较弱的结合水;而1592cm-1是氢键作用最弱的水分子,我们简单称之为“自由水”。根据Noda的理论,正相关峰Ψ(1645/1592cm-1)的出现说明中等强度结合水的扩散速度比自由水快;而负相关峰Ψ(1676/1645cm-1)的出现说明氢键最强的结合水的扩散速度比中等强度的结合水要慢。另外,根据图中显示的1676cm-1与1592cm-1峰的相互关系,发现1592cm-1的扩散速度小于1676cm-1。也就是说,3种状态的水分子中,中等强度的结合水扩散速度最快,而自由水的扩散速度最慢。根据已有文献,纯水中几乎所有的水分子都以氢键结合水的形式存在。所以在我们的体系中,结合水最先扩散进PP网络体系。由于体积的关系,氢键最强的结合水的扩散速度肯定小于中等强度的结合水。由于s-PP膜是一个完全疏水的网络结构,随着扩散进膜中的水分子含量的增多,越来越多的水分子被局限在s-PP的网络体系中无法自由的运动。为了继续扩散,有些水分子的氢键就必须解离以减弱水分子之间的相互作用力。因此,在扩散后期,氢键作用被不断削弱,结合水被迫解离成“自由水”,最后达到动态平衡。因此,ATR晶面先检测到的是结合水,最后才是“自由水”。(2)聚酰胺的结构表征例子:2DFTNIR研究温度对无定型聚酰胺的影响聚酰胺和聚氨酯中的氢键是很多IR光谱研究的热点。虽然对聚酰胺中的氢键研究大多数集中在中红外区域(4000—400cm-1),但是近红外光谱(12500—4000cm-1)目前被证明是一个非常有效的研究带氨基基团的氢键作用的手段。因为在中红外区域,自由的N—H伸缩振动强度(ν(NHf))非常弱,并且经常被有氢键相互作用的N—H伸缩振动(ν(NHb))峰覆盖。而在近红外区域,ν(NHf)峰和ν(NHb)峰分得很清楚,这样就可以较为精确的估计ν(NHf)峰的强度。图7是一系列无定型聚酰胺的FTNIR变温谱图,温度范围从25℃到200℃。图中发现ν(CH)振动峰随温度的变化比较小,而在6300—6800cm-1区域的有关酰胺峰的强度和形态则有剧烈的变化。25℃时,波谱在6535cm-1处出现一个宽峰,而6765cm-1峰则相对较弱。其中6765cm-1峰是ν(NHf)的一阶倍频峰。随着温度的上升,6765cm-1峰位没有变化,但是强度急剧增加,说明自由的NH基团比例的增大。6535cm-1峰位偏往更高的频率,强度下降,而6650cm-1峰的强度有少量增加。因此,我们把6535cm-1峰归属为ν(NHb)的一阶倍频峰。图8是一系列温度范围下得到的无定型聚酰胺的二维谱图。图8(A)中自相关峰6765cm-1峰的出现说明ν(NHf)的一阶倍频峰对温度非常敏感。而负的相关峰(6535/6765cm-1)和(6250/6765cm-1)的出现说明随着温度的升高,ν(NHb)倍频振动和ν(NH)+ν(CH)的振动(6250cm-1)的强度降低。图8(B)中相关峰(6535/6765cm-1)的出现说明带氢键的NH基团的减少和自由的NH基团的增加是不同步的,带氢键的NH基团的峰强减弱比自由的NH基团的峰强增大要快。而这个相关峰的不对称性说明还可能存在6650cm-1峰,这个峰可能是具有弱氢键相互作用的酰胺基团的ν(NHb)倍频振动。这个结果说明在升温过程中,分子间的氢键作用逐渐减弱。同时,(6740/6780cm-1)相关峰的出现说明6765cm-1(2*ν(NHf))有两个来源,而且6780cm-1峰强对温度的响应速度快于6740cm-1峰。6740和6780cm-1两个峰可能分别来自一个端基自由的NH基团和完全自由的NH基团。图9是C—H振动区域的二维谱图。图9(A)中在6010、5980、5900、5810和5690cm-1处都出现了自相关峰。其中,前三个峰属于芳香族C—H振动(ν(CH))的一阶倍频峰,后两个分别是CH2反对称和对称伸缩振动(νas(CH2)和νs(CH2))的一阶倍频峰。结合图7,负相关峰(5810/5690cm-1)的出现说明随着温度的升高,5810cm-1峰强逐步下降,而5690cm-1峰强有少许增强。根据文献,5810cm-1具体归属为以一种高度耦合形式存在的聚酰胺的ν(CH2)倍频振动。在图9(B)异步谱中出现的(5810/5690cm-1)相关峰说明5810cm-1(高度耦合)的变化比5690cm-1(耦合程度较低)要快。同时,从同步谱中得到的(5900/6010cm-1)和(5980/6010cm-1)说明热扰动导致的6010cm-1峰的变化方向和另两个峰相反。另外,这三个峰在异步谱图中形成的相关峰说明6010cm-1峰相对于5900和5980cm-1两个峰来说,在更低的温度就发生变化。而6010cm-1和5810cm-1之间强烈的同步关系,同时没有异步峰的出现,说明这两个峰是同源的。图10把N—H振动区域和C—H振动区域关联起来看相互间的关系。值得一提的是,在异步谱图中,6535cm-1峰变化比5980、5900、5690cm-1要快,而所有的C—H振动都比6765cm-1快。5810、6010和6535cm-1之间没有出现异步峰,说明这三个峰都来自耦合程度较高的聚酰胺。总的来说,自由的和有氢键作用的NH基团之间的异步关系揭示了无定型聚酰胺样品中,不同氢键状态的存在及其分裂是一个非常复杂的机理;6740和6780cm-1相关峰的存在说明自由NH基团的特征峰有两个不同的来源;而在C—H振动区域,5810cm-1(脂肪族)和6010cm-1(芳香族)两个峰对温度很敏感。(3)光降解产物的检测例子:2DRaman光谱研究β-胡萝卜素的非氧化性的光降解行为众所周知,β-胡萝卜素在光和氧的作用下很容易发生迅速降解。而我们还知道,即使没有氧气存在,β-胡萝卜素也很容易发生降解反应。这一特性,使得β-胡萝卜素是一个十分有用的生物相容性的保护材料。而Raman光谱被广泛地应用于研究β-胡萝卜素或其他相关物质上,主要因为β-胡萝卜素具有非常强的Raman散射性。所以,这个工作中,2DRaman相关光谱被用于研究非氧化性的β-胡萝卜素的光降解行为。图11是在无氧条件下,对β-胡萝卜素进行光降解得到的一系列不同时间段的Raman谱图,采集时间分别为0、1、2、5、6、7、8、13天。图12就是对图11中一系列时间分辨的Raman光谱进行二维相关分析,得到的二维同步谱图。在谱上,出现了一个独立的自相关峰1537cm-1。1537cm-1峰代表的究竟是什么物质,现在还没有完全定论,只知道这个峰和β-胡萝卜素的一些顺式异构体有关。然而非常有趣的就是在氧气存在的情况下研究β-胡萝卜素的降解行为时,1537cm-1峰强没有明显增加。由此证明,1537cm-1峰严格来说就是光降解得到的产物,图13中可以更加明显地得到这个结论。图13是对图12在1550—1500cm-1区域的局部放大图。图中,1520cm-1和1522cm-1两个峰都和1537cm-1峰形成负相关峰。1520cm-1和1522cm-1两个峰归属为β-胡萝卜素的共轭结构的伸缩振动。伴随着光降解反应的进行,这两个峰的峰强都开始下降,而1537cm-1峰峰强却开始上升,说明1537cm-1峰正是光降解反应的产物。图14是β-胡萝卜素在光降解反应中得到的二维异步谱图。相关峰Ψ(1537/1522cm-1)Ψ(1537/1520cm-1)的出现说明β-胡萝卜素构象的消失和降解产物的出现准确来说,存在一定的异步关系。也就是说,并不能简单地认为β-胡萝卜素降解的同时生成了新的特征峰位于1537cm-1的降解产物。相反,负相关峰Ψ(1537/1522cm-1)Ψ(1537/1520cm-1)说明在1522、1520cm-1两个峰完全消失前,1537cm-1峰已经出现了。β-胡萝卜素的进一步降解还生成了其他物质,而这些物质的特征峰并不在1537cm-1的位置。为了进一步找出其他的降解产物,1550—1500cm-1和1170—1120cm-1的同步相关区域被放大,如图15所示。同步负相关峰Φ(1522/1133cm-1)和同步正相关峰Φ(1537/1133cm-1)的出现说明1133cm-1也是一个降解产物的特征峰。而在异步图中没有出现相应的异步峰,说明1133cm-1峰和1537cm-1峰是同时出现的。综上所述,2DRaman相关光谱被应用在研究β-胡萝卜素的无氧光降解行为上,并得到了一些非常有趣的结论。二维光谱证实,在无氧条件下,β-胡萝卜素光降解产物较为复杂,在反应的早期就生成特征峰位于1537cm-1的产物,并随着降解反应的进行,还生成了其他产物。通过对不同波数范围的一维谱图进行相关还发现的1133cm-1峰有可能和1537cm-1同源,但也有可能是和1537cm-1峰出现时间大致相同的不同的降解产物。(4)符合及在荧光和文献作用下的应用例子:2D相关技术研究马的心脏肌血球素中色氨酸的荧光光谱色氨酸(Trp)的荧光光谱被广泛用于研究蛋白质的结构和构象变化。用Trp荧光光谱研究蛋白质的优势在于Trp是蛋白质中固有的荧光团,因而可以避免因为使用其他外界干扰而产生的副作用。虽然Trp荧光光谱非常有用,但由于Trp荧光对其在蛋白质中位置的依赖性,所以荧光光谱又经常显得过于复杂而无法分析。例如马的心脏肌血球素(HM)中就包含两种Trp:一种处于第7位的较为亲水,称为W7;另一种处于第14位的则深深包埋在憎水性的蛋白质主体中,称为W14。由于Trp的荧光光谱对外界的极性非常敏感,因此相对于W14,W7荧光峰的峰位发生红移。尽管如此,两者的交叠现象仍很明显,因此文中还应用猝灭技术来辅助研究Trp的荧光光谱。文中应用了碘离子(I-)和丙烯酰胺(AA)两种猝灭剂。由于碘离子处于水相,所以较易亲近W7,而较难和W14接触,而丙烯酰胺则和两者都能够接触。图16是在猝灭剂存在时HM的荧光光谱,其中(A)为I-,(B)为AA。图中虚线描绘的是水的Raman峰。随着猝灭剂含量的增加,荧光强度不断降低。比较两个图,我们发现AA的猝灭效率比I-高。这主要是AA因为能够接触到W7和W14,而I-却无法渗入W14的区域。根据图16(A)计算得出了二维同步和异步谱图,列于图17。同步图中只发现在335nm处出现一个自相关峰。由于选用猝灭剂作为外扰,在猝灭剂浓度增加的情况下,两种Trp的含量都有所降低,因此只出现一个自相关峰。而在异步谱图中,出现了位于Ψ(322/348nm)的相关峰。我们把322nm峰归属为W14,348nm峰归属于W7。这个相关峰说明了二维相关光谱的高分辨率。同时根据Noda的理论,Ψ(322/348nm)还说明348nm峰比322nm峰先变化,这是因为在I-的作用下,W7比W14更容易发生猝灭。图18显示的是在AA作用下得到的二维同步和异步荧光光谱。和I-作用的情况相同,在图18(A)上也只显示一个自相关峰。然而从异步谱图中则看不出任何相关峰的存在。这个结果也不奇怪,因为AA能同时猝灭W7和W14,而且对W7和W14的猝灭速率不会有很大差别,因此异步谱图中就看不见相关峰。另外,值得一提的是一维荧光谱图中出现的水的Raman峰对二维荧光数据处理没有任何影响。这主要是因为猝灭剂的加入并不影响Raman峰的强度,而这也是二维荧光光谱技术的另一大优势,因为在传统的一维荧光光谱中,谱图和容易受一些Raman峰的干扰。2.通过红外谱图检测预聚反应过程中的特征峰把两种不同性质的光谱进行相关分析从而得到有用的信息并不是非常新的想法,但是却非常难以实现。而在广义二维相关技术问世以后,这个问题迎刃而解。上世纪90年代末期已出现用2DIR-NIR光谱研究尼龙12和核糖核酸酶A(ribonucleaseA)的相关报道,但是用二维异谱相关技术进行的研究仍不是很多。本文中介绍的是用2DNIR-IR光谱研究bis(hydroxyethylterephalate)(BHET)的预聚过程。例子:2DNIR-IR光谱研究BHET的预聚过程实时监测化学反应无论对基础理论研究还是工业研究来说都具有及其重要的意义。而各种各样的光谱正日益被证明是在一在线监测的有效手段。用ATR/FTIR和NIR光谱来实时监测BHET在220、250和270℃时的预聚过程。将各个温度下得到的一系列光谱用2DIR、2DNIR进行相关分析,由此得到大量反应过程中的有用信息,并根据2DNIR-IR相关分析的结果确认了乙二醇(EG)在NIR光谱中特征峰的归属。图19是BHET在250℃发生预聚反应时原位测量得到的随反应时间变化的一系列ATR/FTIR谱图。类似地,也得到了220℃和270℃温度下的一系列红外谱图(没有列出)。根据文献,峰的归属也标于图中。对220℃时测得的红外谱图做二维相关分析,得到的二维同步和异步谱图中出现的1032cm-1峰做二维slice分析的结果列于图20。从同步slice图中,发现1032cm-1和880、861cm-1形成正相关峰,说明这三个峰很可能同源。与纯EG的红外谱图(图21)进行比较后,发现这3个峰都是预聚反应中产生的EG的特征峰。通过对预聚反应的NIR光谱的分析,发现5830cm-1峰很可能也是EG的特征峰。由于EG在红外谱中的特征峰已经通过前面的分析得到确认,我们把NIR和IR谱图相关分析,以寻求5830cm-1峰和1032cm-1和880,861cm-1峰的相互关系。在235℃下,用NIR和IR光谱同时监测预聚反应过程,得到的2DNIR-IR相关谱图列于图22中,图A为同步谱图,图B为异步谱图。其中IR的波数范围在1060—800cm-1,NIR的波数范围在6200—5500cm-1。同步谱图中,5830cm-1峰和861、1030cm-1形成正相关峰,而在异步谱中,5830cm-1峰没有和这两个峰相关,这足以证明5830cm-1峰和861、1030cm-1峰同源,都归属为EG的特征峰。三、广义二维相关谱图随着越来越多相关研究人员的介入和发展,二维光谱技术的概念在近几年中早已不仅仅局限于二维相关分析和红外、拉曼、荧光等光谱的结合。本世纪初,广义二维相关光谱在应用光谱上出现了两个新的进展。2002年,Izawa等报道了二维GPC技术,并将之应用于溶胶凝胶(sol-gel)的聚合反应动力学的研究。而Kim等把二维相关分析技术应用到了X射线衍射谱上,来研究电化学反应的机理。同时,Kim充分利用二维异谱相关技术的优势,把X射线衍射谱和拉曼散射谱进行相关来确认一些峰的归属。他们的工作,总的来说让我们更加深切地体会到广义二维相关光谱的广泛适用性。四、有关二维成像技术的扩展和发展本世纪初广义二维相关光谱的理论得到了进一步的发展,由此衍生出了新的二维相关分析方法。1.基于二维相关分析的二维景谱分析技术我们知道,得到一张传统的广义二维相关光谱谱图的基本流程如图1所示。从二维同步和异步谱图上得到的不同波数的光谱强度的变化程度及其相互顺序,我们可以分析得到应用的外扰对所研究的体系的作用,由此来具体化地研究体系的结构/构象变化和反应机理等问题。这种二维相关分析技术可以用术语“二维变量-变量相关技术(2Dvariable-variablecorrelationanalysis)”来表示。但是,如果换种角度思考,发现二维相关光谱,无论是同步还是异步光谱,都可以看作是相关积的矩阵(cross-productmatrices)。另外,广义二维相关光谱技术和主成分分析法(principalcomponentanalysis)有一定的相似性。基于以上理论,Ozaki等人进一步深入探讨广义二维相关光谱技术的本质,提出了“二维样品-样品相关技术(2Dsample-samplecorrelationanalysis)”的概念。通常的二维光谱以波数作x和y轴坐标,对不同峰之间的相互关系进行讨论,而样品-样品相关的二维技术则以任意变量为坐标(例如温度、时间、浓度、压力等),由此直接得到体系浓度的信息。两种二维分析技术的区别,可以用下图(图23)概括。为了从二维样品-样品相关谱图上得到有效的信息,并且能直接和二维变量-变量相关技术(2Dvariable-variablecorrelationanalysis)谱图得到的信息相联系和比较。通常,先把原始的一系列一维谱图进行预处理,然后进行样品-样品二维相关分析,得到样品-样品二维相关分析的同步和异步谱图。与变量-变量二维相关分析得到的结果相比较,发现二维样品-样品相关的同步谱图体现的就是光谱对外扰响应的结果,而样品-样品二维相关的异步谱图体现的就是光谱强度变化的不同速率。然而,样品-样品二维相关技术的表示手法更为直接,更容易让人接受。为了验证二维样品-样品相关分析技术的广泛适用性,Ozaki等人用样品-样品相关技术来研究温敏性油酸(oleicacid)的NIR光谱(图24)。在大量的光谱和物化实验研究的基础上,Iwahashi等人发现温敏性的油酸有3种液体结构:从熔点(15℃)到30℃,油酸是一种准近晶型的液晶结构,30℃到55℃,规整度下降,是一种接近无序的结构,55℃以上,则呈各向同性的结构。而通过样品-样品二维相关技术,从谱图中(见图25)同样得到了两处温度的突变点,32℃和55℃,这不仅从一个新的角度证明了温敏性油酸两次相变和三种结构的存在,也证明了样品-样品相关分析技术的有效性。2.广义二维相关谱图技术目前,我们所说的任何二维振动光谱都是针对同一个体系,在同一个外扰作用下得到的。然而我们知道,有很多情况下,是有两个或两个以上的变量同时作用于所要研究的体系,例如在一个升温的反应过程中,时间(t)和温度(T)两个变量就同时发生变化。两种不同的变量可能会对体系产生相同的作用,而研究两种外扰对体系的协同作用又会是非常有趣的课题。但是如何用二维光谱