西藏红雪茶多糖含量测定方法的研究

西藏红雪茶多糖含量测定方法的研究

红雪茶系地衣科和地衣科的一种植物。形如珊瑚,水泡色红,味苦腥带甘。主要分布在四川省九寨沟、玉龙雪山、牦牛山、药山等、云南省德钦、丽江玉龙雪山、陕西省太白山、青藏高原等海拔数千米的高原之间,生长在落叶松、冷杉干枯树干上。少数民族将其作为山野菜及茶饮,国内外研究发现红雪茶具有清热、抗炎、抗疲劳、抗辐射等作用。本课题组在研究中发现红雪茶多糖具有降血脂作用,为了探索该药效作用与红雪茶多糖含量的关系,拟采用酶标仪,通过测定红雪茶总糖和红雪茶还原糖的含量,计算两者差值的方法,确定红雪茶中多糖的含量。以此为深入开发红雪茶这一珍贵药用资源提供依据。1仪器、试剂和仪器酶标仪(SynergyH1,美国伯腾仪器有限公司),电子天平(AL204,梅特勒-托利多仪器有限公司),台式离心机(TDL-40B,上海安亭科学仪器厂),电子控温电热套(98-1-B,天津泰斯特仪器有限公司),粉碎机(LK-800A,黄冈永安医疗器械有限公司),循环水式多用真空泵(SHB-B95,郑州长城科工贸有限公司),真空干燥箱(DZG-6050D,上海森信实验仪器有限公司),酶标板(costar3590,美国康宁公司);鼠李糖对照品(批号A0134-6166-35-7,华泰生物制品有限公司);红雪茶购自于西藏,经解放军302医院中药研究所肖小河研究员鉴定为梅衣科金丝属中金丝刷(Lethariellacladoniodes)的全株;其余试剂均为分析纯;试验用水为重蒸馏水。2方法和结果2.1红雪了制备红雪平均水提物lc称取红雪茶干燥粗粉100g,加入20倍水浸泡2h,加热煮沸45min,二次煎煮加水5倍量,回流30min,合并水煎液,过滤,滤液60℃减压浓缩干燥,即得红雪茶水提物(LC)。水提物加水200mL,溶解后加入乙醇使含醇量达到80%,4℃冷藏24h。离心取沉淀物,烘干即得红雪茶醇沉物(LCA),LCA加水溶解,依次用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(用量皆为1.0U·mg-1)酶解,透析后再用Sevage法除蛋白,烘干即得红雪茶粗多糖(LCP)。2.2红雪茶醇沉物供试品溶液精密称定LC0.1g,置10mL量瓶中,加水定容,即得红雪茶水提物供试品溶液一(LC1);取LC11mL,置50mL量瓶中,加水定容,得红雪茶水提物供试品溶液二(LC2)。精密称定LCA0.1g,置10mL量瓶中,加水定容,摇匀即得红雪茶醇沉物供试品溶液一(LCA1);取LCA11mL,置50mL量瓶中,加水定容,得红雪茶醇沉物供试品溶液二(LCA2)。精密称定LCP0.2g,置10mL量瓶中,加水定容,摇匀即得红雪茶粗多糖供试品溶液一(LCP1);取LCP11mL,置100mL量瓶中,加水定容,得红雪茶粗多糖供试品溶液二(LCP2)。2.3对照品溶液的制备称取105℃烘干至恒重的鼠李糖对照品0.0320mg,置50mL量瓶中,加水溶解并定容,即得质量浓度为0.64g·L-1的对照品贮存液,精密量取1.563mL置10mL量瓶中,加水定容,摇匀,即得0.1g·L-1对照品溶液。2.5苯酚和亚硫酸钠的制备称取3,5-二硝基水杨酸3.15g,溶于131mL浓度为2.0mol·L-1的氢氧化钠溶液中,将此溶液加入到250mL含有92.5g酒石酸钾钠的热水溶液(水温小于45℃)中,再加入2.5g重蒸苯酚和2.5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后定容至500mL,贮存于棕色瓶中,一周后使用。2.6测量波长的选择2.6.1最大吸收波长确定精密吸取0.1g·L-1对照品溶液1.0mL,蒸馏水,LC2,LCA2,LCP2各0.1mL,分别置10mL具塞试管中,加蒸馏水至2.0mL,精密量取1.0mL6%苯酚的溶液,加入,混匀后,精密量取5.0mL浓硫酸,缓慢加入,摇匀,静置5min后,置沸水浴中,15min后取出,待冷却至常温,分别从各具塞试管中吸取300μL,置酶标板中,以相应试剂为空白,230~999nm扫描吸收光谱,对照品及供试品在480nm处均有最大吸收,故确定最大吸收波长为480nm。2.6.2ds试剂冷却分别精密吸取蒸馏水、0.64g·L-1对照品溶液、LC1,LCA1,LCP1各0.5mL,置10mL具塞试管中,加1.5mLDNS试剂,混匀后,置沸水浴中,5min后取出,待冷却至常温,加水4mL,混匀。分别从各具塞试管中吸取300μL,置酶标板中,230~999nm扫描,吸收曲线呈递减,无最大吸收峰,且在550nm之前,DNS试剂对测定结果有干扰,结合文献资料,最终确定测定波长为550nm。2.7标准曲线的绘制2.7.1标准曲线的绘制分别精密吸取0.1g·L-1对照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL,置10mL具塞试管中,加蒸馏水至2mL,加1.0mL6%的苯酚溶液,混匀,缓慢加入5.0mL浓硫酸,摇匀,静置5min,置沸水浴中加热15min后取出,以相应试剂为空白,于480nm处测定OD值,以鼠李糖的含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。标准曲线方程为OD=0.0514C-0.0146(r=0.9992),在2.5~12.5mg·L-1有良好的线性关系。2.7.2标准曲线的绘制分别精密吸取0.64g·L-1对照品溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL,置10mL具塞试管中,加水至0.5mL,加1.5mLDNS试剂,混匀,置沸水浴中加热5min后取出,以相应试剂为空白,于550nm处测定OD值,以鼠李糖的含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线。标准曲线方程为OD=0.0229C-0.086(r=0.9999),在8~40mg·L-1有良好的线性关系。2.8精密度测试2.9重复试验2.10总糖含量测定精密吸取LCP1供试溶液0.4mL,置10mL具塞试管中,按2.7.1项下方法每隔0.5h测定1次吸光度,连续13次。计算得RSD为1.54%,表明总糖含量测定中,样品溶液在6h内稳定。精密吸取LCP2供试溶液0.5mL,置10mL具塞试管中,按2.7.2项下方法每隔0.5h测定1次吸光度,连续17次。计算得RSD为1.79%,表明还原糖含量测定中,样品溶液在8h内稳定。2.11样品取样性能2.11.加样回收率试验精密量取已知总糖含量(61.4%)的LCP29份,分成3组,每组3份,每份4mL,置10mL量瓶中,分别加入鼠李糖对照品溶液(0.1g·L-1)4.5,5.0,5.5mL,加水定容。2.7.1项下条件测定,并计算平均加样回收率。结果见表1。试验结果表明,平均回收率在97%~102%之间,上述方法具有良好的回收率。2.11.加样回收率试验精密量取已知还原糖含量(1.02%)的LCP19份,分成3组,每组3份,每份6mL,置10mL量瓶中,分别加入鼠李糖对照品(0.64g·L-1)1.8,2.0,2.2mL,加水定容。2.7.2项下条件测定,并计算平均加样回收率。结果见表3。试验结果表明,平均回收率在98%~102%,上述方法具有良好的回收率。2.12样品测定2.12.供试品溶液制备分别取红雪茶,精密称定,按2.1及2.2项下方法制备供试品溶液。精密吸取0.4mL供试品溶液,按2.7.1项下条件测定水提物、醇沉物、粗多糖中总糖质量分数,结果分别为69.4%,86.9%,58.6%。2.12.还原糖质量分数测定分别取红雪茶,精密称定,按2.1及2.2项下方法制备供试品溶液。精密吸取0.3mL供试品溶液(LCP1取0.5mL),按2.7.2项下条件测定水提物、醇沉物、粗多糖中还原糖质量分数,结果分别为5.85%,4.28%,1.02%。2.13红雪茶茶多酚的含量由上述红雪茶总糖含量及还原糖含量,可以分别计算水提物、醇沉物、粗多糖中多糖质量分数为63.6%,82.6%,57.6%。3不同工艺阶段红雪茶多糖含量的变化本实验中采用苯酚-硫酸法测定总糖含量和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量,多糖含量为两者的差值。该法避免了单糖、低聚糖及其他还原性物质对多糖含量测定的干扰,所得多糖含量更接近真实值。总糖和还原糖测定中,曾分别选用葡萄糖、鼠李糖作对照品。显色剂和不同对照品反应,显色强度略有不同,所得标准曲线方程也不同,直接导致计算所得含量值有差异。据文献报道,红雪茶多糖主要由鼠李糖和半乳糖构成,因而采用鼠李糖作为实验对照品。实验中应用酶标仪,其在快速、多通道、用量少等方面较可见-紫外分光光度计有明显优势,并且SynergyH1酶标仪中的光路径校正功能有效弥补了在准确性方面的不足。测定结果表明,各个工艺阶段,多糖含量有较大差异。经醇沉,红雪茶总糖含量提高,这与醇沉能去除脂溶性杂质有关;还原糖含量降低,这可能因多糖不溶于乙醇而保留,单糖、低聚糖等易溶于乙醇而去除。另外粗多糖中总糖和还原糖含量均比醇沉物低,可能因一部分多糖与蛋白结合,在除蛋白时随蛋白一起被去除而损失,在透析时还原糖等小分子被去除有关。通过测定红雪茶中多糖的含量,为进一步研究藏红雪茶多糖含量与降血脂作用的药理药效提供了依据。2.46红雪茶粗粉制备的能力研究称取苯酚200g,加铝片0.2g,碳酸氢钠0.1g,常压油浴蒸馏,收集182℃馏分,称取该馏分80g,置于100mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀后至棕色瓶中,即为80%苯酚液,4℃冷藏备用。精密量取1.875mL80%苯酚液,置25m