专业技术知识01-色谱柱的分类、维护及管理

液相色谱柱的分类、维护与管理研发项目经理李蒲江色谱柱的分离原理色谱柱的分类色谱柱的常见异常现象0102目录CONTENTS030405色谱柱修护与再生色谱柱的管理Part1色谱柱的分离原理目录CONTENTS石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分1906年俄国植物学家Tsweet发现色谱分离现象色谱的起源Part1

色谱柱的分离原理1Basicprincipleofchromatographicseparation1.1色谱分离基本原理PartitioncoefficientK分配系数Part1

色谱柱的分离原理6高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的结构色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱Part1

色谱柱的分离原理硅胶颗粒基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体(键合相)3.端基封尾end-cappedPart1

色谱柱的分离原理Part2色谱柱的分类目录CONTENTS色谱柱的分类Part2

色谱柱的分类色谱柱有多种不同的分类方法根据固定相极性的不同可分为极性色谱柱和非极性色谱柱;根据固定相和流动相的相对极性的不同可分为正相色谱柱和反相色谱柱根据色谱柱填充剂的差别可分为硅胶柱、化学键合硅胶柱、离子交换树脂柱、凝胶柱、玻璃微球柱等。在化学键合硅胶柱中以十八烷基键合硅胶柱应用最广泛，辛基硅烷键合硅胶柱次之，即通常所说的C18和C8柱，胺基柱、腈基柱和苯基柱也偶有使用。根据色谱柱内径的不同，液相色谱柱可分为微径柱、分析柱、快速柱、半制备柱、制备柱等，适用于不同的分离分析目的。常用的普通分析柱，内径通常为4.6mm(3/16in)，柱长15〜25cm，填料粒径5〜10pm，用于常规的分离分析。快速分析柱的内径一般为6mm或更大，柱长30~80mm，填料粒径为3pm或更小。半制备柱与制备柱，内径一般在6mm以上，用于半制备或制备目的。而微径柱内径一般为1mm，甚至有更小内径的毛细管柱，与常规分析柱相比，需要特殊的装填技术，并配合高精度的微流泵(nanopump)使用。01按固定相化学性质分类Part2

色谱柱的分类02色谱柱类型分离原理适用对象填料反相色谱柱用键合非极性基团的载体填充而成的色谱柱,根据物质极性差异进行分离.固定相的极性小于流动相的极性适用于大多数化合物,如蛋白质、肽、氨基酸、核酸、甾体、脂类、脂肪酸、糖类、生物碱等含有非极性基团的化合物十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、辛烷基硅烷键合硅胶(C8)、苯基键合硅胶、硅胶等.正相色谱柱用硅胶或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱,根据物质极性差异进行分离.固定相的极性大于流动相的极性.(也可使用含水流动相，HILIC)适用于非极性至中等极性的中小分子化合物的分离，如脂溶性维生素、甾体激素等硅胶、氨基键合硅胶、氰基键合硅胶等离子交换色谱柱以离子交换树脂或化学键合离子交换剂为固定相,利用被分离组分离子交换能力的差别或选择系数的差别而实现分离。适用于离子或可离解的化合物,如无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素、蛋白质等.有机共聚物树脂、硅胶微球离子交换剂、螯合树脂等.分子排阻色谱柱根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系，对溶质进行分离，大分子的物质保留弱用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖、聚乙烯、聚氯乙烯等葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物、高交联度苯乙烯Ｇ二乙烯基苯共聚物手性拆分色谱柱由具有光学活性的单体,固定在硅胶或其他聚合物上制成手性固定相,通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异,从而实现光学异构体的拆分光学异构体纤维素、环糊精、大环抗生素、蛋白质等按USP编号分类Part2

色谱柱的分类03USP编号填料说明简称L13～10μm十八烷基键合多孔硅胶或无机氧化物微粒固定相ODS柱L230～50μm表面多孔薄壳型键合十八烷基固定相C18柱L3多孔硅胶微粒，即一般的硅胶柱

L430～50μm表面多孔薄壳型硅胶柱

L530～50μm表面多孔薄壳型氧化铝柱

L630～50μm实心微球表面包覆磺化碳氟聚合物，强阳离子交换柱

L7全多孔硅胶微粒键合C8官能团固定相C8柱L8全多孔硅胶微粒键合非交联NH2固定相

3to10μmNH2柱L9强酸性阳离子交换基团键合全多孔不规则形硅胶固定相SCX柱L10多孔硅胶微球键合氰基固定相（CN）CN柱L11键合苯基多孔硅胶微球固定相苯基柱L12无孔微球键合季胺功能团的强阴离子交换柱

L13三乙基硅烷化学键合全多孔硅胶微球固定相（C1）C1柱L1410μm硅胶化学键合强碱性季铵盐阴离子交换固定相SAX柱L15已基硅烷化学键合全多孔硅胶微球固定相C6柱按USP编号分类Part2

色谱柱的分类03USP编号填料说明简称L16二甲基硅烷化学键合全多孔硅胶微粒固定相C2柱L17氢型磺化交联苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,强阳离子交换柱L183～10μm全多孔硅胶化学键合胺基（NH2）和氰基（CN）柱

L19钙型磺化交联苯乙烯－二乙烯基苯共聚物，强阳离子交换柱

L20二羟基丙烷基化学键合多孔硅胶微球固定相（Diol）二醇基柱L21刚性苯乙烯－二乙烯基苯共聚物微球填料柱

L22带有磺酸基团的多孔苯乙烯阳离子交换柱

L23带有季胺基团的聚甲基丙烯酸甲酯或聚丙烯酸酯多孔离子交换柱

L24表面含有大量羟基的半刚性聚乙烯醇亲水凝胶柱

L25聚甲基丙烯酸酯树脂交联羟基醚（表面含有残余羧基功能团）树脂。能分离分子量100～5000范围的水溶性中性、阳离子型及阴离子型聚合物（用聚氧乙烯测定）的固定相

L26丁基硅烷化学键合全多孔硅胶微球固定相2.1×100mm,5μmL2730～50μm的全多孔硅胶微粒

L28多功能载体，100Å的高纯硅胶加以氨基键合以及C8反相键合的官能团

L29氧化铝,反相键合,含碳量低,氧化铝基聚丁二稀小球，5μm，孔径80Å

L30全多孔硅胶键合乙基硅烷固定相

按USP编号分类Part2

色谱柱的分类03USP编号填料说明简称L31季胺基改性孔径2000Å的交联苯乙烯和二乙烯基苯(55%)强阴离子交换树脂

L32L-脯氨酸铜配合物共价键合于不规则形硅胶微粒的配位体的交换手性色谱填料

L33能够分离分子量4000～40000范围蛋白质分子的球形硅胶固定相,pH稳定性好

L34铅型磺化交联苯乙烯－二乙烯基苯共聚物强阳离子交换树脂，9mm球形

L35锆稳定的硅胶微球键合二醇基亲水分子单层固定相，孔径150Å

L365mm胺丙基硅胶键合L-苯基氨基乙酸－3,5二硝基苯甲酰

L37适合分离分子量2000～40000的聚甲基丙烯酸酯凝胶

L38水溶性甲基丙烯酸酯基质SEC色谱柱

L39亲水全多孔聚羟基甲基丙烯酸酯色谱柱

L40Tris3,5－二甲基苯基氨基甲酸酯纤维素涂覆多孔硅胶微球

L41球形硅胶表面固定α1酸糖蛋白固定相

L42C8和C18硅烷化学键合多孔硅胶固定相

L43硅胶微球键合五氟代苯基固定相VertexPFPL44多功能固定相,60Å高纯硅胶基质键合磺酸阳离子交换功能团和C8反相功能团

L45β-环糊精键合多孔硅胶微球

L46季胺基改性苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球

Part3色谱柱的修护与再生目录CONTENTSPart3

色谱柱的修护与再生01色谱柱的修护1.污染的修复在ODS柱再生无效或已知污染严重时，可以采用柱修补的方法解决。只要污染深度不超过5mm左右都可以。方法是将污染部分用特制小铲小心挖去。用柱子相同的固定相加流动相制成浆状，用特制小铲把制成浆状固定相仔细补人挖去部分(尽量使后填补的固定相接近原装的紧密程度)，修平端面即告完成。修好的柱子要颠倒使用一段时间，目的是借助流动相冲洗作用，恢复床层紧密程度。Part3

色谱柱的修护与再生01色谱柱的修护2.1色谱柱非疏水塌陷的修护

塌陷的原因很多。对于不太严重时，可将柱颠倒使用，即可恢复性能，每颠倒一次约维持1～2天。当塌陷严重(5mm左右)，可采用污染的恢复方法，将固定相填补人塌陷部分2.2色谱柱疏水塌陷的修护①70%甲醇等度冲洗12h以上

②10%甲醇等度冲洗12h以上③梯度修护流动相时间甲醇水0-360min7030360-420min1090420-780min1090Part3

色谱柱的修护与再生02色谱柱的再生反向色谱柱再生：①甲醇-水（95:5）甲醇二氯甲烷

②二氯甲烷甲醇甲醇-水（95:5）

③每个流动相需冲洗20-30倍柱体积正相色谱柱再生：①正己烷异丙醇二氯甲烷甲醇

②甲醇二氯甲烷异丙醇正己烷③每个流动相需冲洗20-30倍柱体积离子交换柱的再生：①阴离子柱可使用稀酸缓冲液冲洗②阴离子柱可以使用碱缓冲液冲洗Part4色谱柱的常见异常现象目录CONTENTS01Part4

色谱柱的常见异常现象异常现象原因1、压力为零，不上升或流动相流量为零色谱柱柱前管路接头处泄露2、有柱前压，但流量为零（1）柱进口堵塞（2）色谱柱链接件漏液3、柱前压上升，流量下降，甚至到零（1）柱上端不锈钢多孔滤片被胶片碎沫堵塞，（2）柱下端不锈钢多孔滤片被填料细颗粒堵塞（3）柱子阻力增大，由于以水作为流动相的体系，柱子内微生物生长而使柱子堵塞4、不能调零（1）柱子被污染（2）柱填料中有空气（3）固定相流失过多（4）以前流动相没有冲净5、基线噪声大（1）柱配件或接头处漏液（2）从柱来的颗粒物质通过或进入检测器（3）柱温波动大6、基线突然起变化保留强的溶质，缓慢地从柱中流出7、基线漂移（1）色谱柱被玷污（2）色谱柱固定相流失（3）柱温室温度变化（4）更换流动相后柱子没有达到平衡（5）强吸附组分从柱中洗脱出来色谱柱的常见异常现象与原因01异常现象原因8、没有色谱峰出现色谱柱体系有故障9、出现负峰微量空气进入柱内，并洗脱出来10峰型不好，出现平头峰或拖尾峰色谱柱超负荷色谱柱体系不合适柱子填料特性不良柱外效应11、峰形展宽（1）色谱柱床层塌陷或失效，使用时间过长，修理次数过多（2）进样量超负荷，引起色谱柱及检测器出现饱和现象12、峰形前伸（1）色谱柱床层装填不紧（2）柱子床层断裂（3）柱端部固定相板结13、峰形后延柱外效应严重，尤其是柱后死区大14、出现双峰（1）柱端床层被扰乱（2）经过修补的柱子床端面不平整15、异常峰的出现，如裂头峰或色谱峰严重扩散（1）色谱柱填充不均匀或存在间隙（2）柱顶部塌陷；异常现象原因16、保留时间变长（1）柱温过低（2）梯度系统不合适（3）固定相流失色谱柱的常见异常现象与原因Part4

色谱柱的常见异常现象01异常现象原因17、保留时间减少（1）柱被污染，柱效下降（2）固定相流失（3）梯度系统对色谱柱固定相不合适（4）柱温过高18、分离度下降（1）柱子超负荷（2