传统麻杏石甘汤剂中麻黄碱含量影响因素的研究

传统麻杏石甘汤剂中麻黄碱含量影响因素的研究

由于传统中医复合汤剂（传统汤剂）的使用不方便，近年来开始用于临床应用。传统汤剂是按处方配药,加水共煎而得;颗粒汤剂是将批量的单味中药饮片分别加水煎煮、浓缩、干燥、分装,使用时按处方混合,开水冲服即得。传统汤剂与颗粒汤剂的药效学、临床疗效方面的比较已经有了一些报道,但有关其化学组成方面的报道较少。麻杏石甘汤一方出自东汉名医张仲景《伤寒论》一书,由麻黄6g,苦杏仁9g,甘草6g,石膏24g组成,该方具有辛凉宣肺,清热平喘之功效,主治表邪未解,肺热咳喘证。现代临床经验证明,石膏的用量的大小在麻杏石甘汤治疗咳喘症的疗效上起到了关键的作用,重用石膏能够使该方的疗效大大提高,使咳喘诸症更快得到缓解。在研究麻杏石甘汤传统汤剂与颗粒汤剂中麻黄碱含量时,作者发现其麻黄碱的含量有着极显著性的差异,麻杏石甘汤传统汤剂中麻黄碱质量分数为3.79mg·g-1,麻杏石甘汤颗粒汤剂中麻黄碱为3.29mg·g-1。这一结果说明传统汤剂的混煎与颗粒汤剂的单煎的一些有效成分含量有着较大区别。为了研究麻杏石甘汤中每味药材对麻黄碱溶出的影响因素,作者采用了混料均匀设计法,对麻杏石甘汤进行了拆方研究,对各提取液的麻黄碱用HPLC进行了含量测定,并对测定结果进行了分析。1中药配方颗粒汤剂和传统复方汤剂的制备美国Agilent1100高效液相色谱仪,包括Agilent-G1312A二元泵,G1315B二极管阵列检测器,G1313自动进样器,G1316A柱温箱,G1322A真空脱气机,Agilent-A.08.03化学工作站;超声波清洗机(HS10260D,10L,天津恒奥);800型离心沉淀器(25W,最高转速4000r·min-1,上海手术器械厂)。药材经贵阳中医学院董立莎教授鉴定,麻黄为麻黄科植物草麻黄EphedrasinicaStapf的干燥草质茎、甘草为豆科植物甘草GlycxycrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎、苦杏仁为蔷薇科植物杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟种子、石膏为硫酸盐类矿物硬石膏族石膏GypsumFibrosum.。盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品鉴定所,批号714-9202);麻杏石甘汤中药配方颗粒汤剂和传统复方汤剂(自制);乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。2方法和结果2.1%磷酸3.2%色谱柱:DiamonislC18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相乙腈-0.1%磷酸(5∶95);检测波长207nm;流速1mL·min-1;柱温25℃。在上述条件下,麻黄碱与杂质峰完全分离,空白样品无干扰,见图1。2.2对照溶液的制备精密称取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇溶液制成8.0μg·mL-1的盐酸麻黄碱对照品溶液。2.3照品溶液的制备分别精密吸取盐酸麻黄碱对照品溶液,制备6个不同浓度梯度的盐酸麻黄碱对照品溶液。取10μL注入液相色谱仪,记录色谱,以峰面积积分值(A)对进样量(C)进行线性回归,得线性回归方程A=2070.63C+7.86,r=0.9995,线性范围0.0628～0.1884μg。2.4密度试验精密吸取同一对照品溶液15μL,重复进样6次,RSD0.83%。2.5稳定性研究精密吸取供试品液各10μL,照上述色谱条件,每2h测定1次,各测5次,结果RSD1.54%,说明样品在8h内稳定。2.6标准曲线及标准曲线测定总色谱图称取各味药材9份,按表2量精密加入盐酸麻黄碱对照品,按上述条件各制备高、中、低浓度的供试液各3份,并按色谱条件项下进样,测定峰面积,记录色谱图,计算,结果见表1。2.7麻杏石甘汤配方考察为考察处方组合对盐酸麻黄碱含量的影响,固定各组合中麻黄处方量为6g,对处方中其余三味药材采用混料均匀设计的方法进行设计中心配伍组合。按文献选用混料均匀设计表Un(nS-1)来安排实验,其中n为实验次数和水平数,s为待考察的因素数,在此选表U9(93)。即对复方中3个因素各取9个不同水平并设计成9种不同配方进行考察。具体算法如下:设Un(nS-1)为一个均匀设计表,其中第i行第j列的元素记为Uij;令Cij=(Uij-0.5)n,i=1,2,…,n,j=1,2…,n。则本列中各组分配比为:X1=1-Ci112,Xi2=(1-Ck2)Ci112,Xi3=Ci2Ci112。i=1,2,…,n。X1,X2,X3分别为麻杏石甘汤处方中的3个成分,即炙甘草、苦杏仁、石膏,每类中药在方中配比(表3)的前列,组成了9个X1+X2+X3=1但配比不同的中药组方。麻杏石甘汤整个处方总量为45g,由于麻黄称样量为6g,则其余三味药材的药材量为39g。根据不同配比组方称取药材,按照麻杏石甘汤传统复方汤剂的制备方法分别对9个组合进行制备。具体组方配比见表2。2.8药渣添加量的确定按照各组合的不同组方配比称取药材,加10倍量水常温浸30min,煎煮保持微沸30min,趁热过滤,滤渣加7倍量水煎煮保持微沸20min,趁热滤过,合并2次滤液,药渣水洗3次,与滤液合并,减压浓缩,定容至50mL量瓶中,即得。2.9甲醇的用量精密吸取各组方药液各5mL,置锥形瓶中,精密加入甲醇25mL密塞,称定质量,超声处理(功率160W,频率50kHz)20min,放冷,用甲醇补足质量,摇匀,滤过。精密吸取滤液1mL,置中性氧化铝柱(1cm,100～200目中性氧化铝1.5g,干法装柱)上,用50%甲醇9mL洗脱,收集洗脱液,滴加1滴磷酸,再用50%甲醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。2.10重量测定取各组供试液进样,在上述色谱条件下进行测定,测定不同组方配伍中盐酸麻黄碱含量,结果见表3。2.11回归分析结果采用Excel统计学软件进行逐步回归处理分析,得回归方程Y=4.36719347+7.752707437X2+1.2557197041X3,r=0.85664,n=6,F=8.2712、显著水平P=0.0189。对回归方程的各项系数进行偏相关分析,X2项的P值为0.00543,对Y值的贡献达极显著水平,X3的P值为0.02596,对Y值的贡献达显著水平。由回归方程和偏相关分析结果可看出:X2,X3(苦杏仁、石膏)对整个处方中麻黄碱的含量是有显著性影响,并且该关系是正相关,即二味药材在实验范围内,它们的使用量越大,整个处方煎煮溶出的麻黄碱含量也就越高。其中,X2(苦杏仁)对麻黄碱含量的影响起主要作用,X3(石膏)的影响次之。3不同用量条件下麻黄碱含量的测定由回归方程及偏相关检验可知,麻杏石甘汤中苦杏仁及石膏用量对麻黄碱含量有显著性影响。因此,在实验范围内选择苦杏仁、石膏的最高用量分别为28.7937,27.6198g,最低用量分别为1.3494,1.6926g及中间用量分别为15.0716,14.6562g,分别与6g麻黄、6g炙甘草组成3个复方。分别按上述方法制备3个复方的供试液,定容至50mL量瓶中。同上操作,分别注入液相色谱仪,测定,结果见表4。将验证试验组成的3个复方的药材量分别代入上述回归方程中,得到高、中、低3个不同用量条件下麻杏石甘汤中麻黄碱含量的理论值(其中麻黄的称样量以6.000g计),见表5。由上表可看出,随着处方中苦杏仁、石膏的用量越大,麻黄碱的理论含量越高。从验证试验可看出麻黄碱的含量随着苦杏仁、石膏用量的增大,麻黄碱的含量随之增高。这与理论值的基本趋势相同,即麻黄碱的含量在实验范围内随着苦杏仁、石膏用量的加大而增高。由于中药化学成分的复杂性以及多样性,实际煎煮过程中麻黄碱的含量与回归方程得出的理论值在数值上有一定的差异,但其总体趋势是相同的。因此可认为苦杏仁、石膏对整个处方中麻黄碱的含量是有着显著的影响的,回归方程Y=4.36719347+7.752707437X2+1.2557197041X3有意义,可用。4不同配方中苦杏仁及石膏的用量对麻黄碱含量的影响通过使用混料均匀设计对麻杏石甘汤的组方进行设计以及