基因表达的定量检测分析报告

基

因

表

达

的

定

量

检

测

分

析基因表达

的定量检测方法1.蛋白表达水平的检测：1)定量检测分析：westernblotting、ELISA、HPLC2)蛋白质功能分析：蛋白质亚细胞定位分析：

免疫荧光技术蛋白相互作用研究：

酵母双杂交、免疫共沉淀(

IP)、

荧光共振能量转移(

FRET

)酶活性检测：

ELISA、HPLC2.mRNA

表达水平检测：1

)

半

定

量RT-PCR2)

Northernblot3)

实

时

荧

光

定

量PCR(RealtimePCR)Northernblot

杂交是用来检测真核生物RNA的表达量和大小，

以估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：1.完整mRNA的分离2.根据RN

A

的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离3.将RNA

转移到固相支持物(尼龙膜)上，在转移的过程中，要保持RNA

在凝胶中的相对分布4.将RNA固定到支持物上(UV

交联)5.

固

相RNA与

探

针

分

子

(DNA

或

RNA)杂

交6.除去非特异结合到固相支持物上的探针分子7.对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析ta

Rn

VS

leCycle

NumberDeltaRn·实时荧光定量PCR

技术于1996

年由美国AppliedBiosystems公司推出，

由于该技术不仅实现了PC

R从定性到定量的飞跃，而且

与

常

规PCR

相

比,

它具有特异性

更强、有效

解

决PCR污染问题

、自动化程度高等特点，

目前已得到广泛应用。·

实时荧光定

量PCR

原

理所谓实时荧光定量PCR

技术，是指在PCR

反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR

扩增

反应中每一个循环扩增产物量的变化，

通过Ct值和标准曲

线或内参基因的关系对起始模板进行定量分析的方法。·

与常规PCR技

术比

较：对PCR扩

增反应的终点

产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定

量，

无

法

对

扩

增

反

应

实时

检

测

。Cycle

(

循

环

数

)一般而言，

荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。R

n

(

荧

光

强

度

)在荧光背景信号阶段，

扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，

我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。

PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，

所以根据最终的

PCR

产物量不能计算出起

始DNA拷

贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，

PCR

产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，

在实时荧光定量

PCR

技术中引入了两个非常重要的概念：

荧光阈值和

CT

值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，

但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为

CT

值(threshold

value

)几个常用名词概念1.Ct

值的定义C代表Cycle,t代表threshold

(阈值，临界值),

Ct

值的含义是：

每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。Cycle

(

循

环

数)Rn

(

荧

光

强

度

)2.荧光域值

(

threshold)

的设定PCR

反应的前15

个循环的荧光信号作为荧光本底信号，

荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，

即：

threshold

=

10'SDcycle

3-153.Ct值

与

起

始

模

板的

关系研究表明，

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，

Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，

纵坐标代表Ct

值。因此，只要获得未知样品的Ct

值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Cycle

(

循

环

数

)前15个循环信号作为荧光本底信号

(baseline)荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：

大于荧光背景和阴性对照的荧光最高值；

进入指数期的最初阶段Rn

(

荧光

强

度

)绝对定量分析：Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系Logof

DNAconcentrationCycle

number目的基因PCR目的基因目的基因克隆目的基因质粒质粒提取，

OD值定量，

将质粒梯度稀释作为标准品使用质

粒

标

准

品

的

制

备基

因

组DNA1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，

得标准品iilv标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，

得标准品v拷贝数的计算：待测样本浓度(ng/ul)=OD26o×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数(copies/ul)=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：相对定量分析必须用内对照基因(管家基

因)进行校正，进行相对表达量分析。β-Actin

GAPDHβ-2-microglobulin管家基因：

维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等R

HPRT实验组实验值相

对

定

量

分

析双标准曲线法通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家

基因进行定

量，

然

后

根

据

计

算

公

式

求

得

相

对

值

即

为

相

对表

达

量

。公式：

校正值=

果果结结量量定定因因基基家的管目待

测

样

品

的

校

正

值对

照

样

品

的

校

正

值2

-△△Ct法相

对

值

=2-△△Ct法：假设

目的基因和参照

基因扩

增效

率

都

接

近10

0

%△Ct

(处理

前

)=

1

8

—

1

7

=

1

△Ct(处理后)=16-17.4=

—1.

4△△Ct=△Ct(处理

后)一

△

Ct(

处

理

前

)

=

—

1.4—1=—2.4比

率(处理后/处理前)=2-△△Ct=2-(-24)=5.3修

正

方

法：

如

果

我

们

知

道目

标

基因

和

参

照

基因

有

相同的

扩

增

效

率，

但

扩

增

效

率

不

等

于

2

,

那

么2-△△ct可以修正为：E-△△Ct,

例

如

扩

增

效

率

为

1

.

9

5

,

那

么

计

算

公

式

可

修

正

为

1

.

9

5

-

△

△ctJun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)18161717.42-△△Ct法公

式

：Sample处理前处理后E1.951.95常

用

荧

光

标

记

方

法非特异性荧光标记SYBR

Green

I特

异

性

荧

光

标

记TaqMan

ProbeProbeReporter

QuencherSYBR

Green

I染料法SYBR

Green

I是一种结合于所有dsDNA

双螺旋小沟区域的具

有

绿

色

激发

波

长的

染

料

。SYBR

Green

ISYBR

Green

I染料法—

—作用机理热

变

性

引物

F

F

F

F

荧光物质F延伸反应DNA

聚

合

酶

二引

物

退

火FAMTM,VIC⁸,

NEDTM,

CY5TM&

ROXTMAmplificationPlot

ReportDelta

Rnvs

Cycle1.0e+0001.0e-002Cycle

NumberCy5

FAMVICNED1.0e-001Delta

RnEmissionmaximum(nm)*513517518521538548552552553570582604607615640667707DyeFluoresceinOregon

GreenFAMSYBR

GreenTETJOEVIC@Yakima

YellowWHEXCy°3TAMRACy3.5ROXTexas

RedLightCycler-Red

640(LC640)Cy5Cy5.5Excitationmaximum(nm)490492494494521520538526535552560588587596625643683420

nm>460

nm500

nm540

nm580

nm620

nm660nmEMISSIONCy3Alexa568GFPFITCEXCITATIONDAPICy5Biosearch

BlueTM352

447BHO~-0495CR-430-520mmFAM

495

520TET

521

536CAL

FluorGold

540WIC/TETJDEREPLACENFNT)522

544J0E529555WIC

538

554534

nmBHQ-1

QR=480-580nmTe

579

nmBHQ

-2

OR-559-670

nmBHO-2

dye

is

recommendedfor

Puisar

650,Quasar

670.

and

auasar

705

dyes

dueto

slsc

guencngHEX

535

556CAL

Fluor

Orange

560(WICHECJDEBEPLACEMENT538

559Quasar570(CY3REPLACENENT)548

566CyTM

3

549

566NED546

575TAMRA

557

583CAL

Fluor

Red

590(TAMRAREPLACEMENT)569

591Cy3.5

581

596ROX

586

610CAL

Fluor

Red

610(TEXAS

REDRORFPLACFMENT)590

610Texas

Red

597

616CAL

Fluor

Red

635LC

RED

64个5REPLACENENT)618

637Pulsar

650

460

650Cy

5

646

669Quasar

670(CY5REPLACEMENT)647

670Cy

5.5

675

694Quasar

705(CYS.5REPLACEMENT]690

705BHU-3672

nmCA-620-730

nmDYE-5'-ToEX

EMFLUOROPHOREBHO

Dye*SYBR

Green

I与双链DNA

进行结合后散发荧光，因此如

果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将

同时被检测，

从而可能导致检测结果不准确。设计合适引物，

防止非特异性扩增!融解曲线分析，单一峰

无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰

其他产物出现非特异性荧

光，

因此定量不准确

SYBRGreenI染料法优点：价格便宜，使用方便，

不用设计复杂的探针。缺点：无模板特异性，

对引物特异性要求比较高，不能进行多重定量分析5′端标记有报告基团(Reporter,R),

如FAM、VIC

等3’端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q

)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，

R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3’外切核酸酶活性，可水解探针

Taqman

探

针

法Taqman

探

针

法热

变

性

引

物引

物和探针

与模

板

退火DNA聚

合

酶延

伸

反

应G@2报告基团淬灭基团探

针探

针RRRMolecular

Beacon淬灭基因2.引物退火/探针杂交Polymerase3.延伸反应2.引物退火/探针与模板的杂交Polymerase

B

探针杂交

@Taqman

ProbeMolecularBeacon探针淬灭基因背景荧光更低Primer11

1

」3.延伸反应TTT荧光物质1.热变性1.热变性荧光物质Primer杂交TT反应优化反

应

液

组

成

、

体

积■50ul

绝

对

不

必

要■20ul应用广，但成本高■推荐10ul,

但需要优化引物与引物、

引物与探针浓度配比■

4×

4

组

合

，

5

0nm,300nm,600nm,900nm■

探

针

5

0nm,100nm,250nmqPCR一般使用二步PCR

扩增，在退火-延伸整合步

骤结

束

时

进

行

信

号

检

测

。当

PC

R反映效率低时可以使用三步

PCR扩增

。

染料法可

以在72

℃延伸结束时检测。探针法只

能在

退

火

结

束

时

检

测

。可检测的RNA

种类·含小分子RNA的Total

RNA

·小分子RNA(建议使用)RNA

抽

提

方

法·沉淀法抽提总RNA·

离心柱法富集小RNA更适合

一

次R

T

检

测

特

异

的m

i

RNA

>

因

使

用

探

针

，

特

异

性

高>

相

对

来

讲

灵

敏

度

低

于

染

料

法

检

测适合

多

个

样

本

中

检

测

同

一

m

i

R

N

A>

M

G

B

或

L

N

A

探

针

价

格

较

高>

对

于

R

T

引

物

的

设

计

、

使

用

浓

度及

反

转

录

条

件

需

有

极

高

的

要

求>AB

I在L

o

o

p

反

转

录

法

上

开

发

的Mega

plex

TM

Primer

Pools弥补了其高通量的检测的弱势1

次

R

T

可

检

测

所

有

m

i

R

N

A通

用

性育

无

背

是

泛

沈>

在

mat

u

r

e

-

m

i

R

N

A

低

表

达

的

情

况下，易被极高丰度的Pre

-

m

i

R

N

A

干

扰

检

测

.>

更

适

合

mi

R

N

A

的

高

通

量

检

测

>灵

敏

度

高，

但需

用

融

解曲

线来

进

行

特

异

性

判

断>经

济

、

方

便

3PolyA

polymerase

AAAAAAAAAA….Annealoligo-dTadaptorandRTreaction-AAAA

AAAAAAVTTTTTTT

T3'

TTTTTTTTTcDNA

templateready

for

qPCRaninOmo-minnaarEnpsinarTTTTTTTTTlmssselAmrmiRNA

RTprimer,1Step

1:StemIaop

RTIITII

IIimmcDNA

t

l-

i

PCRForward

primerR

imTerme:apeeTotal

RNAMaturemiRNA3'PolyadenylationReverse

transcription53cDNAqPCRAssayIaqManPoly

A加尾法Loop反转录法5*RcR

PC…pro

bemiENA!LISt

l

op

RT11

IIICDNAStep

2:ForwardPrimerTaqMano:eemiRNAmStep

1:

Ip

Step2:Real-timePGRForwardSybrgreen

l

ReverseRTlteIIm-1S>

检

测

特

异

性

高

于

染

料

法，

但

灵

敏

度

偏

低需采

用

M

G

B

或

L

N

A

修

饰

探

针，成

本

偏

高>

探

针

的

锚

定

位

置

偏

R

T

引

物

部

分

，

设

计

简

单>采用染料法，相对成本偏低.>检测特异性高于PolyA加尾法，但

可能反转录的灵敏度低于PolyA加尾Loop反转录法探针检测

Loop反转录法染料检测Real-time

PCRRT

primerRp

sreprimerIIIIII1

11

HprobeRT1因素建议指标效率5

个

数

量

级

梯

度

稀

释Slope～-3.3R2>0.99精密度至少3个重复标

准

差

<

0

.

2

5(0.

5

或

者1

个

Ct

之内)灵敏度增

加

低

浓

度

样

本的

重

复

数统计分析除了这些因素，还必须评估和验证合适的实验对照(如无模板对照，

无

反转录酶对照等)以及模板质量。评价荧光

PCR

结果的标准>检测荧光信号的步骤有误：一般SG法采用72℃

延伸时采集，Taqman法则

一

般

在退火

结

束

时

或

延

伸

结

束

采

集

信

号

。>引物或

探

针降解

：

可

通

过

PAGE电泳

检测

其完

整

性

。>

模

板

量不

足

：

对未

知浓

度的

样品

应

从系

列

稀

释

样本

的

最高

浓

度

做

起

。模板降解：

避

免

样

品

制

备中杂

质

的引

入

及

反复冻

融

的

情

况

。qPCR可能

出现

的

问

题

及

解

决

方

法1.

无

Ct值

出

现CyeleCyclega

lnes

aradde帆

扩增效率低：反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。>

PCR

各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR

产物太长：

一般采用80-150bp

的产物长度。2.

Ct

值出现过晚

(Ct>38)LogStartingQuantty,copy

number>

加样存在误差：

使得标准品不呈梯度。>标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，

或重新制备并稀释标准品。>

引物或探针不佳：

重新设