卫生指标菌的检测

第五章卫生指标细菌的检验

08十一月20232第一节食品中菌落总数的测定08十一月20233一、菌落总数

概念：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后,单位质量（g）、容积（mL）或表面积（cm2）内所形成的好氧或兼性厌氧细菌菌落的总数。

是活菌计数，需氧菌数；不代表实际所有的细菌总数。08十一月20234二、菌落总数测定的意义1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、了解细菌在食品中的繁殖动态。3、预测食品贮藏期限的长短。08十一月20235三、菌落总数测定的方法※平板倾注法＃平板表面涂布法平板表面点滴法08十一月20236四、平板倾注法测定菌落总数

GB4789.2-2010原理：样品经过稀释后，使样品悬液中的细菌分期存在，接种一定量（一般为1mL）到培养基中，再加入适量的培养基，充分混匀。从理论上讲，微生物在培养基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼可见的菌落。08十一月20237检验步骤(程序)：08十一月20238（一）样品稀释及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46℃营养琼脂15~20mL25g/ml样品生理盐水08十一月20239（一）样品稀释及做平板08十一月202310

检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。

08十一月202311（二）培养倒放平板普通食品：36℃±1℃48h±2h水产品:30℃±1℃72h±3h如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的平板计数琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上步条件进行培养。08十一月202312（三）计数和报告

到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0~4℃，但不得超过24h。08十一月2023131、菌落的选择（1）单个菌做一个菌落计（2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。08十一月2023142、平板菌落计数的选择(1)

选取菌落数在30～300之间的平板（SN标准要求为25～250个菌落）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：08十一月202315式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。08十一月202316注意：旧版标准的做法为：比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字08十一月202317（2）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告（3）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告（4）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告（5）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。

08十一月2023183、菌落数的报告菌落数在1～100时，按“四舍五入”原则，以整数报告；如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g）为单位报告，CFU/g;液体检样以毫升（mL）为单位报告，CFU/mL;表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告，CFU/cm2;。

08十一月20231908十一月202320(四)检验注意事项1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.08十一月2023216、为防止细菌增殖产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20min倾入琼脂，并立即使之与琼脂混合均匀。(在平面上先左右摇动，后顺时针和逆时间旋转)7、加入平皿内的检样稀释液有时带有检样颗粒，需加做平皿放在4℃的环境中，以便计数时排除颗粒的影响。8、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。(四)检验注意事项08十一月202322复习题1、什么是菌落总数？2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？08十一月202323第二节食品中大肠菌群的检验08十一月202324一、大肠菌群

1、

什么是大肠菌群？

指一群在37℃能分解乳糖产酸、产气，需氧及兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。2、大肠菌群的组成:

大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属(又叫产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌)、克雷伯氏菌属的一部分和沙门氏菌属的第III亚属。08十一月202325属代表种致病性埃希氏菌属（Escherichia）大肠埃希氏菌(E.coli)

肠道外感染，急性腹泻志贺氏菌属（Shigella）痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)细菌性痢疾爱德华氏菌属（Edwardsiella）迟纯爱德华氏菌(E.tarda)蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内沙门氏菌属（Salmonella）伤寒沙门氏菌(S.typhi)肠热症、急性肠炎、败血症枸橼酸杆菌属(Citrobacter)弗劳地氏枸橼酸杆菌(C.freundii)条件致病菌，引起继发性感染克雷伯氏菌属(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、创伤感染败血症等阴沟肠杆菌(Enterobacter)产气杆菌(E.aerogenes)很少引起原发性感染哈夫尼亚菌属(Hafnia)蜂窝啥夫尼亚菌(H.alvei)

对人无致病性沙雷氏菌属(Serrati)粘质沙雷氏菌(S.marcescens)条件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及创伤感染变形杆菌属(Proteus)普通变形杆菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等耶尔森氏菌属(Yersinia)

鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)鼠疫欧文氏菌属(Erwinia)草原居民欧文氏菌(E.herbicola)

植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到08十一月2023261、粪便污染的指标菌：可作为粪便污染的指标有：大肠杆菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌；大肠杆菌更适合作为指标菌，但该菌群可因环境而导致菌型的改变；大肠杆菌检验方法繁杂，且并不确切；大肠菌群是更合适的指标菌。二、大肠菌群检验的卫生学意义08十一月2023272、以大肠菌群作为粪便指标菌原因在粪便中数量最大；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容易。二、大肠菌群检验的卫生学意义08十一月202328（1）判断食品中否受到粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。3、大肠菌群检验的意义二、大肠菌群检验的卫生学意义08十一月202329三、大肠菌群的生物学特性1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气

3.培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。08十一月202330EMB平板照片及原理呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽08十一月202331麦康凯琼脂平板Ageofcultureis24h呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润08十一月202332四、大肠菌群检验方法及操作方法国家标准(2003版)：三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)

行业标准：两步法：推测试验→证实试验国家标准(2010版)：两步法：LST发酵→BGLB复发酵08十一月202333GB4789.3-2010月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤08十一月202334大肠菌群检验中常用的抑菌剂胆盐、洗衣粉、SDS、煌绿、结晶紫、孔雀绿等。我国常用胆盐作为抑菌剂，猪、牛、羊3种胆盐检验效果无差别。3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠、兔胆盐会影响大肠菌群的检验结果。用量、品牌、规格会影响结果。08十一月202335MPN法简介TheMostProbableNumberMethod08十一月20233608十一月202337检样稀释处理EMB等革兰氏染色乳糖发酵管革兰氏阴性无芽胞产气革兰氏阳性大肠杆菌阴性大肠杆菌阴性报告不产气乳糖胆盐发酵管产气不产气大肠杆菌阴性报告报告报告大肠杆菌阳性三步法简介08十一月2023381:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml单料乳糖胆盐发酵管单料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管初发酵检样稀释检样量1g/ml检样量0.1g/ml检样量0.01g/mlEMB分离培养证实试验乳糖发酵管镜检查MPN表报告结果08十一月202339第三节粪大肠菌群的检验粪大肠菌群：是大肠菌群的一种，又称为耐热大肠菌群，是指一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。08十一月202340表1粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征培养基菌落特征伊红兰培养基(EMB)紫黑色、有金属光泽，紫黑色、不带或略带光泽，淡紫红色、中心紫黑色、黑红或深紫红色品红亚硫酸纳(远藤氏平板)紫红色、有金属光泽，深红色、不带或略带金属光泽，淡红色、中心较深中国兰平板深蓝色，浅蓝色、中心深蓝色麦康凯平板(MacC)桃红色，粉红色、中心桃红色08十一月202341粪大肠菌群检验程序08十一月20234208十一月2023431、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。2、对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。

3、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。六、检验注意事项08十一月202344第四节食品中大肠杆菌计数大肠杆菌（Escherichiacoli），学名大肠埃希氏菌，被归为肠杆菌科，属于埃希氏菌属，革兰氏阴性短杆菌，能在44.5℃发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为++--，或为-+--。08十一月202345大肠杆菌检验的卫生学意义多数为肠道正常菌群，并产生有益的作用；直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性，它们能引起食物中毒，统称为致病性大肠杆菌；大肠杆菌学用作受粪便污染的重要指标；存活时间与一些常见的肠道病原菌接近，它们的出现可能预示首某些肠道疾病的病原菌存在，如志贺氏菌、沙门氏菌等。08十一月202346检验程序：靛基质(I)、甲基红(M)、VP(Vi)、柠檬酸盐(C)++---+--08十一月20234708十一月202348复习题1、什么是大肠菌群？大肠菌群由哪些微生物组成？2、测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？3、大肠菌群具有哪些生物学特性？4、在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项？5、在水的大肠菌群数检验中，如何进行水样的采集？08十一月202349第五节大肠菌群快速检验食品大肠菌群快速检验方法：LTSE法TTC显色法；DC试管法；纸片法。08十一月202350(一)LTSE法LTSE培养基(Lactose-Tryptone-SodiumDodecylsulfate-TraceElements，LTSE)：P180原理：不同细菌以不同的途径分解糖类，在其代谢过程中产生了丙酮酸及转变为各种酸类，大肠菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氢酶作用于甲酸，产生H2和CO2

气体，因此气体的产生是在产酸的同时进一步分解酸而形成的。据次将样品接种到LTSE培养基肉汤内15h，观察有无气体产生，然后加氧化酶试验和涂片革兰色镜检结果综合判断是否有大肠菌群的存在。

08十一月202351LTSE检验程序P17808十一月202352(二)TTC法

(氯化三苯四氮唑快速显色法)P18108十一月202353（三）DC法

(去氧胆酸钠半固体法)P183~18508十一月202354（四）纸片法P185~18608十一月202355（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片

使用方法：1.样品稀释同国标法2.接种：饮料和饮用水采用原液、1:10、1:100三个稀释度，固体食品采用1:1、1:10和1:100三个稀释度。用1mL灭菌吸管吸取1mL同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。08十一月2023563.培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36℃下培养15－24h观察结果。4.结果判定:纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性.纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性.纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性.酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性08十一月202357（二）餐具大肠菌群快速检验(纸片法)使用方法：1.

采样6—10份。碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于原塑料袋内。筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内。08十一月2023582.将已采样的纸样置于37°C培养15h.

纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。08十一月202359食品冷饮大肠菌群检验纸片

冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定08十一月202360食品饮料大肠菌群快速检验纸片

饮料、食用纯水和糕点的大肠菌群测定08十一月202361餐具大肠菌快速检验纸片

餐具卫生消毒效果检测08十一月202362大肠菌群测试片

适用于需要对大肠菌群准确计数的样品，如消毒牛乳、冷饮和调味品等。

08十一月202363实例：水的大肠菌群检验大肠菌群MPN/100mL细菌总数

CFU/mL

生活饮用水

≤3/L＜100

瓶装饮用纯净水

≤3

≤20

饮用天然矿泉水罐装产品0＜50地面水质量标准

＜10000个/L

准备加氯消毒后供饮用的水≤1000准备加氯消毒后供饮用的水≤10000游泳池水≤100＜100008十一月202364（一）、水样的采集

1、自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流5—10′后取样。2、地面水源水：江湖河，水库，水池等。浸入水下20cm下取样。水井50cm下取样。3、漂白粉处理的水样：自来水，游泳池水，应在瓶内加入0.03g硫代硫酸钠/500ml，或2ml1.5%硫代硫酸钠液/500ml，除氯。4、运送：2小时内送到检验室。6—10℃，<6h,立即检验.5、检验前：将水样振摇5—10分钟。08十一月202365（二）、生活饮用水或食品生产用水的检验（大肠菌群）

各加10ml各加100ml水样初发酵三料乳糖胆盐50毫升装三料乳糖胆盐5毫升装EMB分离36℃培养24h复发酵乳糖发酵镜检36℃培养24h08十一月202366大肠