猪流行性腹泻病毒S基因的研究进展

猪流行性腹泻病毒S基因的研究进展摘要：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引发的猪的一种急性肠道传染病，是造成仔猪早期死亡的重要疫病之一。近年来，猪流行性腹泻的流行区域有扩大的趋势，已成为中国甚至全世界最常见的猪腹泻传染病之一。通过对猪流行性腹泻病毒的基因组概述，S基因及其编码蛋白的功效特性、基于猪流行腹泻病毒S基因的诊疗技术及其疫苗研究进展等方面的进行综述。核心词：猪流行性腹泻病毒；S基因；S蛋白；诊疗技术；疫苗进展Abstract:Swineepidemicdiarrheaisanacuteintestinalinfectioncausedbyporcineepidemicdiarrheavirus,whichisoneoftheimportantdiseasesthatleadtotheearlydeathofpiglets.Inrecentyears,epidemicareasofswineepidemicdiarrheahavebeenexpandingandhavebecomeoneofthemostcommonporcinediarrhea-relateddiseasesinChinaandevenintheworld.ThisreviewsummarizesthegenomeofSwineEpidemicDiarrheavirusandthefunctionalpropertiesofSgeneanditsencodedproteinbasedonthediagnostictechniqueofSgeneofswineepidemicdiarrheavirusandtheresearchprogressofitsvaccine.Keywords:Porcineepidemicdiarrheavirus;Sgene;Sprotein;diagnostictechnique;vaccineprogression引言20世纪70年代初，猪流行性腹泻（PED）在欧洲等国如英国、荷兰、比利时和捷克就被发现，被认定为一种急性肠道传染病，其重要特点为腹泻、脱水以及呕吐。1977年，成功的分离到这种冠状病毒并命名为流行性腹泻病毒（PEDV）。与欧洲等国同时期，我国也出现了新生仔猪的严重腹泻并死亡的事件，采用多个抗生素均无效果，当时被认为是胃肠炎的传染病。到了20世纪80年代初，采用酶标法证明了这种流行病为猪流行性腹泻病毒[1]~[3]。PED现在在全球范畴内流行广泛，特别是在亚洲国家如中国、日本和韩国，这已经给养猪业带来了严重的冲击。现已表明猪流行性腹泻重要是由于猪流行性腹泻病毒造成的一种急性的肠道传染病。PEVD能够造成不同年纪以及不同品种的猪染病引发严重的腹泻，例如成年母猪20%～85%发病，架子猪、哺乳仔猪以及育肥猪100%的发病。重要病症为：症状轻的为日龄大，症状重的为日龄小。具体体现为：成年猪体现为厌食与呕吐，育肥猪和断奶猪的腹泻仅持续7d左右，症状较轻。而日龄较小的哺乳仔猪死亡率达成50%，出现严重的脱水症状。PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，引发的病症日趋复杂，经常出现交叉感染的状况，PED造成猪的整洁度差、成活率减少、减缓生长速度、推迟上市时间、病毒的易感性、增重减少、增加额外消耗、减少饲料运用率、减少牲畜抗病力、增加对细菌并增加发病率，提高治疗费用、猪拉稀体重下降、休克、死亡、牲畜脱水等十分严重的后果，因此需要引发从业人员的高度重视[5]。１PEDV的基因组研究PEDV基因组属于单股正链感染性的RNA，基因组全长28Kb左右，与其它冠状病毒相似，在基因组5’端有一种帽子构造（cap），基因组5′非翻译区（5’URT）长度为300bp左右[6]~[8]。3′端有一种polyA尾，基因组3’非翻译区（3’URT）长度为330bp左右，剩余的基因组涉及6个开放阅读框（OFR），从5’→3’端依次为ORF1（0bp左右）、S基因（4100bp左右）、ORF3（670bp左右）、E基因（230bp左右）、M基因（680bp左右）、N基因（1300bp左右）。PEDV基因重要编码构造蛋白分别为S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白。Ｓ蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白[9]，由1383个氨基酸构成，含有29个潜在的糖基化位点，同其它冠状病毒相似。E蛋白是最小的构造蛋白，该蛋白位于病毒粒子的囊膜上，氨基酸包埋在脂质双层中且N-端朝向病毒粒子的外部，-OH位于粒子内部，单次跨膜。M蛋白是由226个氨基酸构成、分子质量为27-32Ku之间的膜糖蛋白，在病毒粒子的组装和出芽过程中含有重要作用［9］。N蛋白由441个氨基酸组成，分子质量为55-58Ku，其中含有6-7个丝氨酸磷酸化位点，是PEDV已知构造蛋白中唯一的磷酸化蛋白，也是构成病毒核衣壳的构造基础，在病毒基因组的转录复制中起重要作[10]。2S基因S基因编码病毒的纤突蛋白，该基因的启动密码子普通并不是用于启动蛋白质的合成，而是翻译分子质量为1383个氨基酸编码的多肽。S基因核苷酸长短不一，其核苷酸长度在4143bp～4161bp之间[11]~[13]。现在，有关PEDV的S基因的分子流行病学数据研究较多，通过研究发现，S基因可用来作为PEDV基因分型的一种根据，可将其分为2个大的基因群，G1基因群和G2基因群，各个亚群均可细分为2个小的遗传分支，即G1-1、G1-2和G2-1、G2-2。研究还发现，G1基因群均存在有碱基缺失或插入现象（以基因插入为主）；而G2基因群则不同，其重要存在有碱基缺失（3bp或6bp）现象[14]。氨基酸分析表明，G1基因群PEDV毒株既存在大量的氨基酸点突变外，又存在氨基酸插入和缺失现象；但G2基因群PEDV毒株却不存在氨基酸插入现象，以氨基酸点突变为主。G1基因群PEDV毒株氨基酸序列与CV777（G2基因群代表株）的同源性为93.0％～93.8％[15]-[18]。由于PEDV只有一种血清型，氨基酸的变异并不会对血清型产生影响，但推测其和疫苗的推荐使用亲密有关。对PEDV新流行株的S基因序列分析发现，PEDV流行株S基因已出现缺失（197aa）和插入（4aa），表明随着疫苗的使用，PEDV基因组进化趋势增强[18]。以S基因绘制PEDV遗传进化树发现，PEDV可分为2个明显的分支G1和G2，G1分支重要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV早期分离株，而G2分支均为新PEDV流行株，重要在韩国、美国等地流行[19]-[21]。3S蛋白S蛋白是由1383个氨基酸构成、分子质量为180~220ku、位于病毒粒子表面的纤突蛋白，它在识别靶细胞，增进病毒和细胞膜的融合中发挥重要地生物学作用[22]~[23]。由于含有PEDV重要的抗原决定簇，有较好的免疫原性，故在机体的抗病毒免疫中起重要[24]，且它在构造蛋白中的含量最高，用其制备的免疫血清是病毒抗原检测试剂的良好择[24]。S蛋白缺少蛋白水解位点，而TGEV在此位点上可产生氨基和羧基亚单位S1S2。序列比较分析证明PEDV同HCV229E抗原有关。但PEDV还另外有250个残基的N端区，而这是HCV229E和TGEV的呼吸道变异株PRCV所缺少的[25]~[27]。尽管S蛋白在感染过程不被切割成S1和S2亚基，但是在相对应的位置上存在这2个基序，这为PEDVS蛋白的受体结合域、抗原区(S1区)和膜融合区(S2区)的人为划分提供了根据[28]。其中S蛋白的C端有一疏水残基链(1322~1337个氨基酸)，预测在此处可形成α螺旋，起着膜受体的作用。孙东波等[27]对已知冠状病毒S蛋白抗原表位和抗原表位区进行了分析，发现现在已经鉴定的冠状病毒S蛋白抗原表位重要位于S蛋白N2端1/2的区域，成果在S蛋白Sl区83~276氨基酸区域预测到1个抗原表位区。另外，S蛋白有27~29个潜在的糖基化位点，在pH4.0低渗非离子溶剂中溶解度最大[29]~[31]。其在病毒粒子成熟后不能被细胞蛋白酶切割，这样就减少了病毒的细胞融合力和感染力，这也是PEDV人工细胞培养困难的因素。4基于PEDV S基因的诊疗技术由于PED与TGE有着极为相似的临床症状和病理变化, 因此确诊PED需要结合实验室诊疗办法。现在，用于PEDV检测的办法有许多，例如病毒分离、免疫电镜观察、病毒的中和实验、免疫荧光技术等，这些办法均能对PED做出精确的诊疗, 但这些技术操作复杂并且耗时[32]~[34]。病毒与宿主细胞吸附和受体识别的重要蛋白之一是S蛋白，且S 蛋白具良好的反映原性和免疫原性，因此在免疫学诊疗技术中应用较广[35]。有研究表明，用N蛋白和S蛋白建立ELISA办法分别进行比较探索，发现在免疫测定中S-ELISA法更为有效。研究发现，猪感染猪流行性腹泻后，检测到血清中的抗N蛋白抗体远不及抗S蛋白抗体，可在更长的时间中检测到抗S蛋白的抗体[36]~[38]。随着人们对ELISA办法不停地进一步研究,该办法被广泛地应用到临床实践中，此办法可用于检测抗体，也可检测抗原，相比较其它检测办法，更为简便、敏感。Gerber等[39]根据PEDV S1蛋白的生物学特性建立了间接ELISA办法，对检测IgA和IgG抗体都含有良好的特异性和敏感性。Paudel等[40]根据PEDV S基因分别体现的S1蛋白、S2蛋白、S3蛋白，分别建立了ELISA办法，对400头免疫疫苗的猪血清进行抗体水平检测，与血清中和实验(SN)相比、S3基因体现蛋白建立的ELISA办法更符合SN，表明S3基因是重要的中和抗原基因,在遗传免疫中起着重要作用[41]。Ishikawa等[42]根据S基因序列设计了一对特异性引物，扩增出854 bp大小的目的片段, 成功地建立了诊疗PEDV的RT-PCR法。S基因保守区域也能够作为检测靶点[43]~[44]。5基于S基因的疫苗研究进展将PEDV的S基因在烟草中进行体现，将提取的转基因植物蛋白给小鼠注射，然后进行血清蚀斑减数中和测定，实验成果证明S基因含有良好的免疫原性，通过用这种转基因烟草饲喂小鼠，发现其能够刺激小鼠产生系统免疫和黏膜免疫[45]~[47]。以烟草花叶病毒为载体将S蛋白中和表位在无烟碱烟草中进行体现，体现蛋白接种仔猪，发现能够诱导仔猪机体产生保护性免疫反映。这些研究成果为PEDV转基因疫苗的开发与研究奠定了一定基础，但是研究发现，转基因植物本身体现抗原的效率过低，并且其生物安全性也有待进一步讲究[38]。通过以重组腺病毒和重组沙门氏菌作为活载体，构建的PEDV疫苗能够针对病毒，产生有效地全身免疫反映和局部黏膜免疫应答[48]。以重组PEDVS1蛋白和N蛋白的干酪乳杆菌给猪和小鼠口服，即使不能够诱导机体产生中和抗体，但却能激发高水平局部黏膜IgA抗体和非中和抗体的全身免疫反映。由于活载体疫苗存在生物安全性、遗传稳定性尚未拟定的缺点，因此国际上商品化的活疫苗不常见[49]。赵德等将PEDVS基因中含有保护性的C-COE基因片段与乳酸菌重组后进行小鼠免疫，前两次间隔1周免疫1次，共进行3次免疫，最后一次免疫间隔2周后进行PEDV抗体检测，实验成果显示以乳酸菌载体制备的疫苗，能刺激机体产生特异性抗体，另外，口服免疫途径比注射产生高水平的抗体更容易，进一步证明乳酸菌载体疫苗更适宜于口服免疫[50]。焦茂兴等将含有PEDV疫苗株的sM、M、S基因与腺病毒进行重组构建了重组腺病毒,研制了PED口服重组腺病毒疫苗。6总结现在对PEDV

S基因的研究，重要集中在基因构造分析及功效预测、蛋白免疫原性分析、遗传进化分析等方面。经重组菌或重组病毒等多个形式体现的S基因的多个保守性中和抗原表位，在通过以小鼠作为动物模型的实验中体现出良好的免疫原性的优势，但同时也存在不少令人担忧的问题，例如，重组菌或重组蛋白诱导细胞和体液免疫水平不够明显，与传统疫苗相比存在保护效力局限性的缺点，新型诊疗办法或疫苗在临床实践应用较少等[51]。另外，虽已证明pAPN为PEDV细胞受体，但有关S蛋白与pAPN受体结合后如何进行一系列信号转导促使细胞膜重排和融合等机制还需进一步研究来揭示。参考文献[1]陈刚,李伟,张阳,等.猪流行性腹泻的研究进展[J].世界华人消化杂志,,1:11.[2]李蕾,刘新文,殷颖珊.猪流行性腹泻研究进展[J].南方农业,,8(15):136-137.[3]赖婷婷,陈樨,张如梅.猪流行性腹泻病毒基因组研究进展[J].动物医学进展,,36(06):119-121.[4]刘政龙,王金良,沈志强.猪流行性腹泻病毒研究进展[J].中国畜牧兽医,,42(09):2506-2511.[5]孔园园,范京惠,左玉柱,邸晶美,刘宝京,罗尚星.猪流行性腹泻病毒S基因的研究进展[J].猪业科学,,33(11):102-105.[6]陈弟诗,任玉鹏,张斌,李丽,聂艳如,周莉媛.猪流行性腹泻病毒S基因研究进展[J].动物医学进展,,35(07):77-81.[7]郭春和,黄毓茂,项林盛,唐丽云,甘建平,郭强,焦茂兴.猪流行性腹泻病毒构造蛋白及疫苗的研究进展[J].畜牧与兽医,,43(12):83-87.[8]范京惠,左玉柱,任晓峰.猪流行性腹泻病毒的基因构造及其诊疗技术[J].世界华人消化杂志,,21(01):54-59.[9]王凤,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,甘振磊,刘志杰.猪流行性腹泻病毒基因及其疫苗的研究[J].猪业科学,,27(12):42-47.[10]张月,王敏,胡莉萍,李玉杰,孔祥华,曹振山,姜秀云.猪流行性腹泻病毒分子构造、诊疗术和疫苗的研究进展[J].山东畜牧兽医,,36(01):77-79.[11]HuyNX，YangMS，KimTG．ExpressionofaCholeraToxinBSubunit-NeutralizingEpitopeofthePorcineEpidemicDiarrheaVirusFusionGeneinTransgenicLettuce(LactucasativaL)［J］．Mo-lecularBiotechnolog，48:201-209．[12]MasterPS．Themolecularbiologyofcoronaviruses［J］．AdvVirusRes，，66:193-292．[13]斯特劳BE．猪病学［M］．8版．赵德明，张仲秋，沈建忠，译．北京:中国农业大学出版社，:181-187．[14]TetsuoS，NatsumiT，AtsushiK，etal．Mutationsinthespikegeneofporcineepidemicdiarrheavirusassociatedwithgrowthadaptationinvitroandattenuationofvirulenceinvivo［J］．VirusGenes，，43:72-78．[15]孙东波，冯力，时洪艳，等．猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展［J］．动物医学进展，，27(10):11-14．[16]KweonCH，KwonBJ，JungTS，etal．Isolationofporcineepi-demicdiarrheavirus(PEDV)inKorea［J］．KoreanJVetRes，1993，33:249-254．[17]KocherhansR，BridgenAAckermannM，etal．Completionoftheporcineepidemicdiarrhoeacoronavirus(PEDV)genomesequence［J］．Genes，，23:137-144．[18]KubotaS，SasakiO，AmimotoK，etal．Detectionofporcineepi-demicdiarheavirususingpolymerasechainreactionandcomparisonofthenucleocapsidproteingenesamongstrainsofthevirus［J］．JVetMedSci，1999，61:827-830．[19]BridgenA，KocherhansR，ToblerK，etal．Furtheranalysisofthegenomeofporcineepidemicdiarhoeavirus［J］．AdvExpMedBiol，1998，440:781-786．[20]BrianDA，BancRS．Coronavirusgenomestructureandreplication［J］．CurrTopMicrobiolImmunol，，287:1-30．[21]SinghM．AnovelinternalopenreadingframeproductexpressedfromapolycistronicmRNAofporcineepidemicdiarrhoeavirusmaynotcontributetovirus［J］．JGenViro1，1999，80:l959-1963．[22]DuarteM，LaudeH．Sequenceofthespikeproteinoftheporcineepidemicdiarhoeavirus［J］．JGenVira1994，75:1195-1200．[23]KmlgTJ，SeoJE，KhnDH，etal．CloningandsequenceanalysisoftheKoreanstrainofspikegeneofPorcineepidemicdiarrheavirusandexpressionofitsneutralizingepitopeinplants［J］．ProteinExprPurif，，41(2):378-383．[24]姜艳平，葛俊伟，汪淼，等．猪流行性腹泻病毒S基因片段的原核体现及其体现产物的反映原性［J］．中国兽医科学，，39(7):602-607．[25]KIMSY,SONGDS,PARK B K.Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR[J].J VetDiagn Invest :13: 516-520.[26]Gerber PF,Gong Q,Huang YW,et al. Detection of antibodies againstporcineepidemicdiarrheavirusinserumandcolostrumbyindirectELISA[J].Veterinary Journal,,202(1):33-36.[27]PaudelS,ParkJE,ShinHJ,et al.Comparision of serum neutralization and enzyme linked immunosorbent assay on sera from epidemic diarrhea virus vaccined pigs[J].Veterinary Quarterly,,34(4):218-223. [28]KANGTJ,KIMYS, et al. Expressionofthesynthtic neutralizing epitope gene of porcineepidemicdiarrheavirusintobaccoplantswithoutnicotine[J].Vaccine, ,23:2294-22997.[29] Brian DA，Baric RS．Corona virus genome structure and replication[J]．Curr Top Microbiol Immunol，，287：1-30．[30] Knipe DM，Howley PM，Griffin DE，et a l．Fields virology(5thed)[M]. Phi-ladelphia: Lippincott Williams﹠Wilkins，：707-736.[31] Kang TJ，Seo JE，Kim DH，et a1．Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of Porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitopeinplants[J]．Protein Expr Purif，，41（2）：378-383．[32] H.F.Egberink，J. Ederveen，P.Callebaut，et a1．Characterization of the structural proteins of porcine epizootic diarrhea virus， strain CV777，Am.J. Vet.Res.49 （1988）：1320-1324．[33] Fan JH，LiYJ．Cloning and sequence analysis of the M gene of Porcine epidemic diarrhea virus LJB/03[J]．Virus Genes．，30（1）：69-73．[34] Lee HK，Yeo SG．Cloning and sequence analysis of the nu cleocapsid gene of Porcine epidemic diarrhea virus Chinju99[J]．Virus Genes，，26（2）：207-212．[35] 余丽芸，侯喜林．流行性腹泻病毒M基因与甲病毒载体重组RNA的构建[J]．动物医学进展，，26（5）：73-76．[8] 王明，马思奇，等．猪流行性腹泻灭活疫苗的研究[J]．中国畜禽传染病，1993，（5）：17-19．[36] 马思奇，王明，冯力，等．猪流行性腹泻病毒适应vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗免疫效力实验[J]．中国畜禽传染病，1994（2）：15-18．[37] Song DS，Park BK，et al．Oral efficacy of Vero Cell Attenuated Porcine Epidemic Diarrhea Virus DR13 Strain[J]．Res Vet Sci，，82(1)：134-140．[38] Kweon CH，Kang YB，Kwon BJ，et al．Derivation of Attenuated Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV) as Vaccine Candidate[J]．Vac